Hin dIII (pronunciado "Hin D Three") es una enzima de restricción desoxirribonucleasa específica de sitio de tipo IIaislada de Haemophilus influenzae que escinde la secuencia palindrómica de ADN AAGCTT en presencia del cofactor Mg 2+ mediante hidrólisis . [1]
Endonucleasa de restricción HindIII | ||||||||
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![]() Estructura cristalográfica del dímero de endonucleasa de restricción HindIII (cian y verde) complejado con ADN de doble hélice (marrón) basado en las coordenadas PDB : 2E52 . | ||||||||
Identificadores | ||||||||
Símbolo | RE_Hindiii | |||||||
Pfam | PF09518 | |||||||
InterPro | IPR019043 | |||||||
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endonucleasa de restricción hindIIIR tipo II | ||||||
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Identificadores | ||||||
Símbolo | hindIIIR | |||||
Gen NCBI | 950303 | |||||
PDB | 2e52 Más estructuras | |||||
UniProt | P43870 | |||||
Otros datos | ||||||
Número CE | 3.1.21.4 | |||||
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![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/e/e0/HindIII_Restriction_site_and_sticky_ends_vector.svg/220px-HindIII_Restriction_site_and_sticky_ends_vector.svg.png)
La escisión de esta secuencia entre los AA da como resultado salientes 5 'en el ADN llamados extremos pegajosos :
5'-A | AGCT T-3 '
3'-TTCGA | A-5 '
Las endonucleasas de restricción se utilizan como mecanismos de defensa en organismos procarióticos en el sistema de modificación de restricción . Su función principal es proteger el genoma del huésped contra la invasión de ADN extraño, principalmente ADN de bacteriófago . También hay evidencia que sugiere que las enzimas de restricción pueden actuar junto con las enzimas de modificación como elementos egoístas, o pueden estar involucradas en la recombinación y transposición genética . [2]
Estructura de la enzima
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/en/1/10/BglII_catalytic_site_2.png)
La estructura de HindIII es compleja y consta de un homodímero. Como otras endonucleasas de restricción de tipo II, se cree que contiene un núcleo estructural común que comprende cuatro láminas β y una única hélice α . Cada subunidad contiene 300 aminoácidos y la masa molecular prevista es 34,950 Da. A pesar de la importancia de esta enzima en la biología molecular y la tecnología del ADN, hay poca información disponible sobre el mecanismo de reconocimiento del ADN y la escisión del enlace fosfodiéster . [1] Sin embargo, se cree que HindIII utiliza un mecanismo común de reconocimiento y catálisis del ADN que se encuentra en otras enzimas de tipo II como Eco RI , Bam HI y Bgl II . Estas enzimas contienen el motivo de secuencia de aminoácidos PD- (D / E) XK para coordinar Mg 2+ , un catión necesario para escindir el ADN en la mayoría de las endonucleasas de restricción de tipo II. [4] Se cree que el cofactor Mg 2+ se une a las moléculas de agua y las lleva a los sitios catalíticos de las enzimas, entre otros cationes. A diferencia de la mayoría de las endonucleasas de restricción de tipo II documentadas, HindIII es única porque tiene poca o ninguna actividad catalítica cuando el Mg 2+ se sustituye por otros cofactores, como Mn 2+ . [1]
Mutagénesis dirigida al sitio
A pesar de la incertidumbre sobre la relación estructura-catálisis de las endonucleasas de tipo II, la mutagénesis dirigida al sitio de la endonucleasa de restricción HindIII ha proporcionado mucha información sobre los residuos de aminoácidos clave implicados. En particular, las sustituciones de Asn por Lys en el residuo 125 y Leu por Asp en el residuo 108 disminuyeron significativamente la unión al ADN y la función catalítica de Hin dIII. [1] En un estudio de mutagénesis separado, se demostró que una mutación en el residuo 123 de Asp a Asn reducía la actividad enzimática. A pesar de que este residuo es más probablemente responsable del desenrollamiento del ADN y la coordinación con el agua en lugar de la interacción directa con el nucleófilo atacante , se desconoce su función específica. [4]
Mecanismo propuesto
Si bien las enzimas de restricción se escinden en secuencias de ADN específicas, primero se requiere que se unan de manera no específica a la cadena principal del ADN antes de localizarse en el sitio de restricción . En promedio, la enzima de restricción formará de 15 a 20 enlaces de hidrógeno con las bases de la secuencia de reconocimiento. Con la ayuda de otras interacciones de van der Waals , este enlace facilita un cambio conformacional del complejo ADN-enzima que conduce a la activación de centros catalíticos. [2]
A pesar de la falta de evidencia que sugiera un mecanismo exacto para la escisión del ADN por HindIII, el análisis de mutagénesis de sitio junto con estudios más detallados de catálisis mediada por iones metálicos en Eco RV han llevado al siguiente mecanismo catalítico propuesto. Se ha sugerido que durante la hidrólisis del ADN por EcoRV, el residuo catalítico Lys-92 estabiliza y orienta el nucleófilo del agua atacante , mientras que el carboxilato de Asp-90 estabiliza el anión hidróxido saliente hasta la coordinación de Mg 2+ . Además, la función enzimática depende de la posición correcta del residuo Asp-74, lo que sugiere que tiene un papel en el aumento de la nucleofilia de la molécula de agua atacante. [5]
Como resultado de los experimentos de mutagénesis del sitio descritos anteriormente, se propone que Lys-125, Asp-123 y Asp-108 de HindIII funcionan de manera similar a Lys-92, Asp-90 y Asp-74 en EcoRV , respectivamente. . Lys-125 posiciona la molécula de agua atacante mientras que Asp-108 mejora su nucleofilia. Asp-123 coordina a Mg2 + que a su vez estabiliza el ion hidróxido saliente.
Usos en investigación
HindIII, así como otras endonucleasas de restricción de tipo II, son muy útiles en la ciencia moderna, particularmente en la secuenciación y mapeo de ADN . A diferencia de las enzimas de restricción de tipo I, las endonucleasas de restricción de tipo II realizan una escisión muy específica del ADN. Las enzimas de restricción de tipo I reconocen secuencias específicas, pero escinden el ADN al azar en sitios distintos de su sitio de reconocimiento, mientras que las enzimas de restricción de tipo II escinden solo en su sitio de reconocimiento específico. [6] Desde su descubrimiento a principios de la década de 1970, las enzimas de restricción de tipo II han revolucionado la forma en que los científicos trabajan con el ADN, particularmente en ingeniería genética y biología molecular .
Los usos principales de las enzimas de restricción de tipo II incluyen el análisis de genes y la clonación. Han demostrado ser sistemas de modelado ideales para el estudio de las interacciones proteína-ácido nucleico, las relaciones estructura-función y el mecanismo de evolución . [2] Hacen buenos ensayos para el estudio de mutaciones genéticas por su capacidad para escindir específicamente el ADN para permitir la eliminación o inserción de ADN. Mediante el uso de enzimas de restricción, los científicos pueden modificar, insertar o eliminar genes específicos , una herramienta muy poderosa, especialmente cuando se trata de modificar el genoma de un organismo .
Referencias
- ^ a b c d Tang, D; et al. (2000). "Análisis mutacionales de endonucleasa de restricción-HindIII mutante E86K con mayor actividad y especificidad alterada" . Ingeniería de proteínas . 13 (4): 283–9. doi : 10.1093 / protein / 13.4.283 . PMID 10810160 .
- ^ a b c Pingoud, Alfred; Jeltsch, Albert. (2001). "Estructura y función de las endonucleasas de restricción tipo II" . Investigación de ácidos nucleicos . 29 (18): 3705–27. doi : 10.1093 / nar / 29.18.3705 . PMC 55916 . PMID 11557805 .
- ^ Lukacs C y col. (2000). "Comprensión de la inmutabilidad de las enzimas de restricción: estructura cristalina de BglII y su sustrato de ADN a una resolución de 1,5 A" . Nat. Struct. Biol . 7 (2): 134–40. doi : 10.1038 / 72405 . PMID 10655616 . S2CID 20478739 .
- ^ a b Tang D y col. (1999). "Mutagénesis dirigida al sitio de la endonucleasa de restricción HindIII" . Biosci. Biotechnol. Biochem . 63 (10): 1703–7. doi : 10.1271 / bbb.63.1703 . PMID 10586498 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ Horton N, Newberry K, Perona J (1999). "Catálisis asistida por sustrato mediada por iones metálicos en endonucleasas de restricción tipo II" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95 (23): 13489–94. doi : 10.1073 / pnas.95.23.13489 . PMC 24846 . PMID 9811827 .
- ^ Roberts, Richard J. (2005). "Cómo las enzimas de restricción se convirtieron en los caballos de batalla de la biología molecular" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 102 (17): 5905–8. doi : 10.1073 / pnas.0500923102 . PMC 1087929 . PMID 15840723 .