Ensayo de hibridación
Un ensayo de hibridación comprende cualquier forma de hibridación cuantificable, es decir, la hibridación cuantitativa de dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos , conocida como hibridación de ácidos nucleicos . [1]
Visión general
En el contexto de la bioquímica y el desarrollo de fármacos, un ensayo de hibridación es un tipo de ensayo de unión de ligando (LBA) que se utiliza para cuantificar ácidos nucleicos en matrices biológicas. Los ensayos de hibridación pueden realizarse en solución o en un soporte sólido, como placas de 96 pocillos o perlas marcadas.
Los ensayos de hibridación involucran sondas de ácido nucleico marcadas para identificar moléculas de ADN o ARN relacionadas (es decir, con un grado significativamente alto de similitud de secuencia) dentro de una mezcla compleja de moléculas de ácido nucleico no marcadas . La terapia antisentido , ARNip y otros bioterapéuticos basados en oligonucleótidos y ácidos nucleicos pueden cuantificarse con ensayos de hibridación.
La señalización de los métodos de hibridación se puede realizar usando sondas de oligonucleótidos modificadas en síntesis con haptenos y ligandos de moléculas pequeñas que actúan de forma homóloga a los anticuerpos de captura y detección. Al igual que con el ELISA tradicional , se pueden usar conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP) como anticuerpos secundarios.
Ensayo de hibridación en sándwich
En el formato de ensayo ELISA de hibridación en sándwich , el ligando de antígeno y los anticuerpos en ELISA se reemplazan con un analito de ácido nucleico, sondas complementarias de captura y detección de oligonucleótidos. [2]
Generalmente, en el caso de la hibridación de ácido nucleico, la concentración de sal monovalente y la temperatura se controlan para la hibridación y la rigurosidad del lavado, al contrario de un ELISA tradicional, donde la concentración de sal se fijará normalmente para las etapas de unión y lavado (es decir, PBS o TBS). Por tanto, la concentración de sal óptima en los ensayos de hibridación varía según la longitud y la composición de la base del analito, las sondas de captura y detección.
Ensayo de hibridación competitivo
El ensayo de hibridación competitivo [3] es similar a un inmunoensayo competitivo tradicional . Como otros ensayos de hibridación, se basa en la complementariedad, donde la sonda de captura compite entre el analito y el trazador, un análogo oligonucleotídico marcado del analito.
Ensayo de hibridación-ligadura
En el ensayo de hibridación-ligación [4] [5], una sonda molde reemplaza la sonda de captura en el ensayo sándwich para la inmovilización en el soporte sólido. La sonda molde es completamente complementaria al analito oligonucleotídico y está destinada a servir como sustrato para la ligadura mediada por ligasa de ADN de T4 . La sonda molde tiene además un estiramiento adicional complementario a una sonda de ligación de modo que la sonda de ligación se ligue sobre el extremo 3 ' del analito. Aunque genérica, la sonda de ligación es similar a una sonda de detección en el sentido de que está marcada con, por ejemplo, digoxigenina para la señalización aguas abajo. Un lavado riguroso, bajo / sin sal eliminará los productos no ligados.
La ligadura del analito a la sonda de ligadura hace que el método sea específico para el extremo 3 'del analito, siendo la ligadura por ADN ligasa T4 mucho menos eficiente sobre un bucle abultado, lo que sucedería para una versión 3' del metabolito N-1 de el analito, por ejemplo. La especificidad del ensayo de hibridación-ligación para la ligación en el extremo 3 'es particularmente relevante porque las nucleasas predominantes en la sangre son exonucleasas 3' a 5 ' .
Una limitación del método es que requiere un hidroxilo libre en el extremo 3 'que puede no estar disponible cuando los restos diana se unen al extremo 3', por ejemplo. Además, las químicas de ácidos nucleicos más exóticas con fármacos oligonucleotídicos pueden afectar la actividad de la ligasa, que debe determinarse caso por caso.
Ensayo de hibridación de ligación dual
El ensayo de hibridación de ligación dual (DLA) [6] extiende la especificidad del ensayo de hibridación-ligación a un método específico para el compuesto original. A pesar de la solidez del ensayo de hibridación-ligación, la sensibilidad y la especificidad añadida para el extremo 3 'del analito oligonculeótido, el ensayo de hibridación-ligación no es específico para el extremo 5' del analito.
El DLA está destinado a cuantificar el compuesto oligonucleotídico original de longitud completa únicamente, con los extremos 5 'y 3' intactos. Las sondas DLA se ligan en los extremos 5 'y 3' del analito mediante la acción conjunta de la ADN ligasa de T4 y la polinucleótido quinasa de T4 . La quinasa fosforila el extremo 5 'del analito y la ligasa unirá la sonda de captura al analito a la sonda de detección. Por tanto, las sondas de captura y detección en el DLA pueden denominarse sondas de ligación. En cuanto al ensayo de hibridación-ligación, el DLA es específico para el compuesto original porque la eficiencia de la ligación sobre un bucle abombado es baja y, por lo tanto, el DLA detecta el analito de longitud completa con los extremos 5 'y 3' intactos. El DLA también se puede utilizar para la determinación de metabolitos individuales en matrices biológicas.
Las limitaciones del ensayo de hibridación-ligación también se aplican al ensayo de ligación dual, con el extremo 5 'además del extremo 3' requiriendo tener un hidroxilo libre (o un grupo fosfato). Además, las ADN ligasas de T4 son incompatibles con la ligadura de moléculas de ARN como donante (es decir, ARN en el extremo 5 'de la ligadura). Por lo tanto, el antisentido de segunda generación que comprende 2'-O-metil ARN, 2'-O-metoxietilo o ácidos nucleicos bloqueados pueden no ser compatibles con el ensayo de ligación dual.
Ensayo de hibridación de nucleasas
El ensayo de hibridación de nucleasas, [7] [8] también llamado ensayo de corte de nucleasas S1 , es un ELISA de hibridación basado en ensayos de protección de nucleasas . El ensayo utiliza nucleasa S1 , que degrada el ADN y ARN monocatenario en oligo o mononucleótidos, dejando intactos el ADN y ARN bicatenario.
En el ensayo de hibridación de nucleasas, el analito de oligonucleótidos se captura en el soporte sólido, como una placa de 96 pocillos, mediante una sonda de corte completamente complementaria. Después del procesamiento enzimático por la nucleasa S1, la sonda de corte libre y la sonda de corte hibridaron con metabolitos, es decir , los cortocircuitos del analito se degradan, permitiendo que la señal se genere solo a partir del dúplex sonda-analito de corte de longitud completa.
El ensayo es bien tolerante a diversas químicas, como lo demuestra el desarrollo de un ensayo de nucleasa para oligonucleótidos morfolino . [9]
Esta configuración de ensayo puede carecer de solidez y no es adecuada para la validación siguiendo las pautas de la FDA para la validación de métodos bioanalíticos . Esto se demuestra por la ausencia de un método publicado que haya sido validado según los estándares establecidos por la FDA para los métodos bioanalíticos.
Referencias
- ^ kim, Kalitsis, ji hun, paul; et al. "Ácidos nucleicos: hibridación" . wiley . Consultado el 4 de febrero de 2017 .
- ^ Efler, SM; Zhang, L .; Noll, BO; Uhlmann, E .; Davis, HL (2005), "La cuantificación de oligodesoxinucleótidos en plasma humano con un ensayo de hibridación novedoso ofrece una sensibilidad mucho mayor que la electroforesis en gel capilar", Oligonucleotides , 15 (2): 119-131, doi : 10.1089 / oli.2005.15.119 , PMID 15989426
- ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "Un ensayo de hibridación enzimática competitiva para la determinación en plasma de oligonucleótidos antisentido de fosfodiéster y fosforotioato", Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584–3589, doi : 10.1093 / nar / 25.18.3584 , PMC 146941 , PMID 9278477 [ enlace muerto ]
- ^ Deverre, Jean-Robert; Boutet, Valérie; Boquet, Didier; Ezan, Eric; Grassi, Jacques; Grognet, Jean-Marc (1997), "Un ensayo de hibridación enzimática competitiva para la determinación en plasma de oligonucleótidos antisentido de fosfodiéster y fosforotioato", Nucleic Acids Research , 25 (18): 3584–3589, doi : 10.1093 / nar / 25.18.3584 , PMC 146941 , PMID 9278477 [ enlace muerto ]
- ^ B1 Patente de EE.UU. 6355438 B1 , Brenda F. Baker; Zhengrong Yu y Janet M. Leeds, "Método para cuantificar oligonucleótidos", publicado el 12 de marzo de 2002, asignado a Isis Pharmaceuticals, Inc
- ^ Tremblay, Guy A .; Khalafaghian, Garinée; Legault, Julie; Bartlett, Alan (marzo de 2011), "Ensayo de hibridación de ligación dual para la determinación específica de terapias con oligonucleótidos", Bioanalysis , 3 (5): 499–508, doi : 10.4155 / bio.11.18 , PMID 21388263
- ^ Patente estadounidense 8163477 , Zhengrong Yu; Brenda F. Baker & Hongjiang Wu, "Método basado en nucleasas para detectar y cuantificar oligonucleótidos", publicado el 24 de abril de 2012, asignado a Isis Pharmaceuticals, Inc
- ^ Xiaohui, Wei; Dai, Guowei; Marcucci, Guido; Liu, Zhongfa; Hoyt, Dale; Blum, William; Chan, Kenneth K. (2006), "Un ensayo ELISA específico basado en hibridación picomolar para la determinación de oligonucleótidos de fosforotioato en plasma y matrices celulares", Pharmaceutical Research , 23 (6): 1251-1264, doi : 10.1007 / s11095-006 -0082-3 , PMID 16718617
- ^ Burki, Umar; Keane, Jonathan; Blain, Alison; O'Donovan, Liz; Marcha, Michael J .; Laval, Steven H .; Straub, Volker (2015), "Desarrollo y aplicación de un método ELISA basado en hibridación ultrasensible para la determinación de oligonucleótidos morfolino fosforodiamidato conjugado con péptidos", Nucleic Acid Therapeutics , 25 (5): 275-284, doi : 10.1089 / nat. 2014.0528 , PMC 4576940 , PMID 26176274
- Biología Molecular
- Ácidos nucleicos
