Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una macromolécula o una molécula pequeña en una solución mediante el uso de un anticuerpo (generalmente) o un antígeno (a veces). La molécula detectada por el inmunoensayo a menudo se denomina " analito " y en muchos casos es una proteína , aunque pueden ser otros tipos de moléculas, de diferentes tamaños y tipos, siempre que los anticuerpos adecuados tengan las propiedades requeridas para se desarrollan el ensayo. Analitos en líquidos biológicos como suero u orinase miden con frecuencia mediante inmunoensayos con fines médicos y de investigación. [1]
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Los inmunoensayos vienen en muchos formatos y variaciones diferentes. Los inmunoensayos se pueden ejecutar en múltiples pasos con reactivos que se agregan y se lavan o se separan en diferentes puntos del ensayo. Los ensayos de varios pasos a menudo se denominan inmunoensayos de separación o inmunoensayos heterogéneos. Algunos inmunoensayos se pueden realizar simplemente mezclando los reactivos y la muestra y realizando una medición física. Dichos ensayos se denominan inmunoensayos homogéneos o, con menor frecuencia, inmunoensayos sin separación.
El uso de un calibrador se emplea a menudo en inmunoensayos. Los calibradores son soluciones que se sabe que contienen el analito en cuestión y, en general, se conoce la concentración de ese analito. La comparación de la respuesta de un ensayo a una muestra real con la respuesta del ensayo producida por los calibradores permite interpretar la fuerza de la señal en términos de la presencia o concentración de analito en la muestra.
Principio
Los inmunoensayos se basan en la capacidad de un anticuerpo para reconocer y unirse a una macromolécula específica en lo que podría ser una mezcla compleja de macromoléculas. En inmunología, la macromolécula particular unida por un anticuerpo se denomina antígeno y el área de un antígeno al que se une el anticuerpo se denomina epítopo .
En algunos casos, un inmunoensayo puede usar un antígeno para detectar la presencia de anticuerpos, que reconocen ese antígeno, en una solución. En otras palabras, en algunos inmunoensayos, el analito puede ser un anticuerpo en lugar de un antígeno.
Además de la unión de un anticuerpo a su antígeno, la otra característica clave de todos los inmunoensayos es un medio para producir una señal medible en respuesta a la unión. La mayoría de los inmunoensayos, aunque no todos, implican unir químicamente anticuerpos o antígenos con algún tipo de marca detectable. Existe una gran cantidad de marcadores en los inmunoensayos modernos y permiten la detección a través de diferentes medios. Muchos marcadores son detectables porque emiten radiación, producen un cambio de color en una solución, emiten fluorescencia bajo luz o pueden inducirse a emitir luz.
Historia
A Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson se les atribuye el desarrollo de los primeros inmunoensayos en la década de 1950. Yalow aceptó el Premio Nobel por su trabajo en inmunoensayos en 1977, convirtiéndose en la segunda mujer estadounidense en ganar el premio. [2]
Los inmunoensayos se volvieron considerablemente más simples de realizar y más populares cuando se demostraron técnicas para enzimas ligadas químicamente a anticuerpos a fines de la década de 1960. [3]
En 1983, el profesor Anthony Campbell [4] de la Universidad de Cardiff reemplazó el yodo radiactivo utilizado en el inmunoensayo por un éster de acridinio que produce su propia luz: la quimioluminiscencia . Este tipo de inmunoensayo se utiliza ahora en alrededor de 100 millones de pruebas clínicas cada año en todo el mundo, lo que permite a los médicos medir una amplia gama de proteínas, patógenos y otras moléculas en muestras de sangre. [5]
En 2012, la industria de inmunoensayos comerciales ganó US $ 17.000.000.000 y se pensaba que tenía perspectivas de un crecimiento anual lento en el rango del 2 al 3 por ciento. [6]
Etiquetas
Los inmunoensayos emplean una variedad de etiquetas diferentes para permitir la detección de anticuerpos y antígenos. Normalmente, los marcadores se unen o conjugan químicamente con el anticuerpo o antígeno deseado.
Enzimas
Posiblemente, una de las etiquetas más populares para usar en inmunoensayos son las enzimas . Los inmunoensayos que emplean enzimas se denominan inmunoensayos enzimáticos (EIA), de los cuales los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y la técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT) son los tipos más comunes.
Las enzimas utilizadas en los ELISA incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa . Estas enzimas permiten la detección a menudo porque producen un cambio de color observable en presencia de ciertos reactivos. En algunos casos, estas enzimas se exponen a reactivos que hacen que produzcan luz o quimioluminiscencia .
Isótopos radioactivos
Se pueden incorporar isótopos radiactivos en reactivos de inmunoensayo para producir un radioinmunoensayo (RIA). La radiactividad emitida por los complejos anticuerpo-antígeno unidos puede detectarse fácilmente usando métodos convencionales.
Los RIA fueron algunos de los primeros inmunoensayos desarrollados, pero han caído en desgracia en gran parte debido a la dificultad y los peligros potenciales que presenta el trabajo con radiactividad. [7] [8]
Reporteros de ADN
Un enfoque más nuevo de los inmunoensayos implica la combinación de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR) y las técnicas de inmunoensayo tradicionales. La etiqueta utilizada en estos ensayos, denominada PCR inmunocuantitativa en tiempo real (iqPCR), es una sonda de ADN . [9] [10]
Reporteros fluorogénicos
Los reporteros fluorogénicos como la ficoeritrina se utilizan en varios inmunoensayos modernos. [11] Las micromatrices de proteínas son un tipo de inmunoensayo que a menudo emplea informadores fluorogénicos. [12]
Etiquetas electroquimioluminiscentes
Algunas etiquetas funcionan mediante electroquimioluminiscencia , en la que la etiqueta emite luz detectable en respuesta a la corriente eléctrica. [13] [14]
Inmunoensayos sin etiqueta
Si bien generalmente se emplea algún tipo de etiqueta en los inmunoensayos, hay ciertos tipos de ensayos que no se basan en etiquetas, sino que emplean métodos de detección que no requieren la modificación o etiquetado de los componentes del ensayo. La resonancia de plasmón de superficie es un ejemplo de técnica que puede detectar la unión entre un anticuerpo no marcado y antígenos. [15] Otro inmunoensayo sin etiqueta demostrado implica medir el cambio en la resistencia en un electrodo a medida que los antígenos se unen a él. [dieciséis]
Clasificaciones y formatos
Los inmunoensayos se pueden ejecutar en varios formatos diferentes. Generalmente, un inmunoensayo caerá en una de varias categorías dependiendo de cómo se realice. [17]
Inmunoensayos competitivos y homogéneos
En un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. A continuación, se mide la cantidad de analito no unido marcado. En teoría, cuanto más analito hay en la muestra, más analito etiquetado se desplaza y luego se mide; por lo tanto, la cantidad de analito no unido marcado es proporcional a la cantidad de analito en la muestra.
Inmunoensayos competitivos y heterogéneos
Como en un inmunoensayo homogéneo competitivo, el analito no marcado en una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. En los ensayos heterogéneos, el analito marcado no unido se separa o se lava y se mide el resto del analito marcado marcado.
Inmunoensayos no competitivos de un sitio
El analito desconocido de la muestra se une a los anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados no unidos se eliminan por lavado y se miden los anticuerpos marcados unidos. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de analito desconocido.
Inmunoensayos no competitivos de dos sitios
El analito en la muestra desconocida se une al sitio del anticuerpo, luego el anticuerpo marcado se une al analito. Luego se mide la cantidad de anticuerpo marcado en el sitio. Será directamente proporcional a la concentración del analito porque el anticuerpo marcado no se unirá si el analito no está presente en la muestra desconocida. Este tipo de inmunoensayo también se conoce como ensayo sándwich, ya que el analito está "intercalado" entre dos anticuerpos.
Ejemplos de
Ensayos clinicos
Una amplia gama de pruebas médicas son inmunoensayos, llamados inmunodiagnósticos en este contexto. Muchas pruebas de embarazo caseras son inmunoensayos, que detectan el marcador de embarazo gonadotropina coriónica humana . [18] [19] Otros inmunoensayos clínicos incluyen pruebas que miden los niveles de CK-MB para evaluar la enfermedad cardíaca, insulina para evaluar la hipoglucemia , antígeno prostático específico para detectar el cáncer de próstata y algunos también se usan para la detección y / o medición cuantitativa de algunos compuestos farmacéuticos (consulte Técnica de inmunoensayo de enzimas multiplicadas para obtener más detalles). [20]
Análisis antidopaje deportivo
Los inmunoensayos se utilizan en los laboratorios deportivos antidopaje para analizar las muestras de sangre de los atletas en busca de la hormona de crecimiento humana recombinante prohibida (rhGH, rGH, hGH, GH). [21]
Investigar
Inmunoensayo fotoacústico
El inmunoensayo fotoacústico mide señales acústicas de baja frecuencia generadas por etiquetas de nanopartículas metálicas. Iluminadas por una luz modulada en una longitud de onda de resonancia de plasmón, las nanopartículas generan una fuerte señal acústica, que se puede medir con un micrófono. [22] El inmunoensayo fotoacústico se puede aplicar a las pruebas de flujo lateral, que utilizan nanopartículas coloidales. [23]
Ver también
- ELISA
- MELISA
- CEDIA
- Inmunodetección
- Nefelometría
- Prueba de flujo lateral
- Inmunoensayo magnético
- Radioinmunoensayo
- Inmunoensayo de fibra óptica envolvente (SOFIA)
- Inmunoensayo basado en CD / DVD
- Aglutinación-PCR
Referencias
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enlaces externos
"The Immunoassay Handbook", tercera edición, David Wild, Ed., Elsevier, 2008
- Inmunoensayo en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Capítulo 5 y 6 del libro "Química bioanalítica" de Susan R. Mikkelsen