Los modelos de enfermedades humanas isogénicas son una familia de células que se seleccionan o diseñan para modelar con precisión la genética de una población de pacientes específica, in vitro . Se les proporciona una 'célula normal' genéticamente emparejada para proporcionar un sistema isogénico para investigar la biología de la enfermedad y nuevos agentes terapéuticos. [1] Pueden usarse para modelar cualquier enfermedad con una base genética. El cáncer es una de esas enfermedades para la que se han utilizado ampliamente modelos de enfermedades humanas isogénicas.
Modelos históricos
Los modelos de enfermedades isogénicas humanas se han comparado con 'pacientes en un tubo de ensayo', ya que incorporan las últimas investigaciones sobre enfermedades genéticas humanas y lo hacen sin las dificultades y limitaciones que implica el uso de modelos no humanos. [2]
Históricamente, las células obtenidas de animales, típicamente ratones, se han utilizado para modelar vías relacionadas con el cáncer. Sin embargo, existen limitaciones obvias inherentes al uso de animales para modelar enfermedades determinadas genéticamente en humanos. A pesar de una gran proporción de conservación genética entre humanos y ratones, existen diferencias significativas entre la biología de ratones y humanos que son importantes para la investigación del cáncer. Por ejemplo, las principales diferencias en la regulación de los telómeros permiten que las células murinas eludan el requisito de regulación positiva de la telomerasa , que es un paso limitante en la formación del cáncer humano. Como otro ejemplo, ciertas interacciones ligando-receptor son incompatibles entre ratones y humanos. Además, los experimentos han demostrado diferencias importantes y significativas en la capacidad de transformar células, en comparación con las células de origen murino. Por estas razones, sigue siendo esencial desarrollar modelos de cáncer que empleen células humanas. [3]
Vectores de target
Las líneas celulares isogénicas se crean mediante un proceso llamado direccionamiento de genes homólogos. Los vectores dirigidos que utilizan la recombinación homóloga son las herramientas o técnicas que se utilizan para bloquear o eliminar la mutación que causa la enfermedad deseada o SNP ( polimorfismo de un solo nucleótido ) que se va a estudiar. Aunque las mutaciones de la enfermedad se pueden recolectar directamente de pacientes con cáncer, estas células generalmente contienen muchas mutaciones de fondo además de la mutación específica de interés, y típicamente no se obtiene una línea celular normal coincidente. Posteriormente, los vectores dirigidos se utilizan para " anular " o " anular " mutaciones genéticas que permiten un cambio en ambas direcciones; de un genotipo normal a canceroso; o viceversa; en líneas celulares de cáncer humano caracterizadas tales como HCT116 o Nalm6. [4]
Existen varias tecnologías de selección de genes que se utilizan para diseñar la mutación deseada, las más frecuentes de las cuales se describen brevemente, incluidas las ventajas y limitaciones clave, en la tabla de resumen a continuación.
Técnica | Gene Knock-In | Eliminación de genes |
---|---|---|
rAAV (vectores de virus adenoasociados recombinantes) [5] | Las inserciones o modificaciones dirigidas se crean dentro de genes endógenos; y por lo tanto están sujetos a:
El rAAV puede introducir mutaciones puntuales sutiles, SNP, así como pequeñas inserciones con alta eficiencia. Además, muchos estudios revisados por pares han demostrado que el rAAV no introduce ningún evento genómico fuera del objetivo de confusión. [ cita requerida ] Parece ser el método preferido que se está adoptando en el mundo académico, biotecnológico y farmacéutico en función de la precisión frente al tiempo frente al costo. [ cita requerida ] | | Los knockouts de genes se encuentran en el locus endógeno y, por lo tanto, son definitivos, estables y relevantes para el paciente. No se producen efectos de confusión fuera del objetivo en otros loci genómicos. Requiere un proceso de 2 pasos:
Por tanto, este proceso puede generar 3 genotipos (+ / +; - / + y - / -); permitiendo por tanto el análisis de la función génica haplo-insuficiente. La limitación actual es la necesidad de apuntar secuencialmente a alelos individuales, lo que hace que la generación de líneas celulares anuladas sea un proceso de dos pasos. |
Recombinación homóloga basada en plásmidos | La inserción está en el locus endógeno y tiene todos los beneficios anteriores, pero es muy ineficaz. También requiere una estrategia de selección de fármacos sin promotor que implique la generación de construcciones a medida. Con este método se ha generado un gran banco histórico de líneas celulares que ha sido desplazado por otros métodos desde mediados de la década de 1990. | La deleción se encuentra en el locus endógeno y tiene todos los beneficios anteriores, pero es ineficaz. También requiere una estrategia de selección de fármacos sin promotor que implique la generación de construcciones a medida. |
Flip-in | Ésta es una técnica eficaz que permite la inserción dirigida de transgenes "ectópicos" en un único locus genómico predefinido (integración a través de un sitio de recombinasa FLP ). Esta no es una técnica para modificar un locus endógeno. Los transgenes estarán normalmente bajo el control de un promotor exógeno, o una unidad promotora parcialmente definida en la ubicación genómica incorrecta. Por lo tanto, su expresión no estará bajo la misma regulación genómica y epigenética que los loci endógenos, lo que limita la utilidad de estos sistemas para estudiar la función de los genes. Sin embargo, son buenos para provocar una expresión génica exógena rápida y estable. | No aplica |
Nucleasas de dedos de zinc (ZFN) | Se ha informado que las ZFN logran altas tasas de desactivación genética dentro de un gen endógeno diana. Si las ZFN se administran conjuntamente con una construcción transgénica homóloga al gen diana, también se pueden lograr inserciones o knock-in genéticos. [6] Un posible inconveniente es que cualquier ruptura de doble hebra fuera del objetivo podría conducir a inserciones de genes fuera del objetivo, deleciones y una inestabilidad genómica más amplia; confundiendo el genotipo resultante. [7] Sin embargo, no se observó un aumento medible en la tasa de integración de plásmidos aleatorios en células humanas editadas de manera eficiente con ZFN que se dirigen a un sitio de reconocimiento compuesto de 24 pb [6] | Las ZFN son endonucleasas dirigidas por secuencia que permiten la interrupción rápida y altamente eficiente (hasta el 90% en una población de células a granel) de ambos alelos de un gen diana, aunque no se han informado alteraciones de pérdida de función relevantes para el paciente o definidas por el usuario en frecuencias similares. Las deleciones o inserciones fuera del objetivo en otras partes del genoma son una preocupación importante. La ventaja de la velocidad de obtener un KO bialélico en un paso también se mitiga parcialmente si todavía se necesita derivar una línea celular clonal para estudiar la función génica en una población celular homogénea. |
Meganucleasas | Las meganucleasas son operativamente análogas a las ZFN. Existen limitaciones inherentes a su uso, como el diseño del vector de meganucleasa, que puede tardar hasta 9 meses y costar decenas de miles de dólares. [ cita requerida ] Esto hace que las meganucleasas sean más atractivas en aplicaciones de alto valor como la terapia génica, la agrobiotecnología y la ingeniería de líneas de bioproductores. |
Recombinación homóloga en modelos de enfermedad de células cancerosas
La recombinación homóloga (HR) es un tipo de recombinación genética en la que se intercambian secuencias genéticas entre dos segmentos similares de ADN. La HR juega un papel importante en la división de células eucariotas, promoviendo la diversidad genética a través del intercambio entre los segmentos correspondientes de ADN para crear combinaciones de genes nuevas y potencialmente beneficiosas.
Los recursos humanos desempeñan un segundo papel vital en la reparación del ADN, lo que permite la reparación de roturas de doble cadena en el ADN, que es una ocurrencia común durante el ciclo de vida de una célula. Es este proceso el que se desencadena artificialmente por las tecnologías anteriores y se inicia para generar 'knock-ins' o 'knockouts' en genes específicos5, 7.
Se descubrió un avance clave reciente utilizando vectores de recombinación homólogos de AAV, que aumentan las bajas tasas naturales de HR en células humanas diferenciadas cuando se combinan con secuencias de vectores dirigidos a genes.
Diagrama de un vector rAAV típico (fuente: https://www.horizondiscovery.com/gene-editing/raav )
Comercialización
Los factores que condujeron a la reciente comercialización de modelos isogénicos de enfermedades de células cancerosas humanas para la industria farmacéutica y los laboratorios de investigación son dobles.
En primer lugar, el patentamiento exitoso de la tecnología mejorada de vectores dirigidos ha proporcionado una base para la comercialización de los modelos celulares que resultan de la aplicación de estas tecnologías.
En segundo lugar, la tendencia de tasas de éxito relativamente bajas en la RnD farmacéutica y los enormes costos han creado una necesidad real de nuevas herramientas de investigación que ilícitamente cómo los subgrupos de pacientes responderán positivamente o serán resistentes a las terapias contra el cáncer dirigidas en función de su perfil genético individual.
Hay varias empresas que trabajan para abordar esta necesidad; a continuación se proporciona una lista de los actores clave y su oferta tecnológica.
- Horizon Discovery: Génesis (rAAV)
- Cellectis: Meganucleases [ enlace muerto permanente ]
- Invitrogen: FLP
- Sigma-Aldrich: dedos de zinc
Ver también
Referencias
- ^ Torrance CJ, Agrawal V, Vogelstein B, Kinzler KW (octubre de 2001). "Uso de células cancerosas humanas isogénicas para detección de alto rendimiento y descubrimiento de fármacos". Nat. Biotechnol . 19 (10): 940–5. doi : 10.1038 / nbt1001-940 . PMID 11581659 .
- ^ Gupta, Piyush B .; Kuperwasser, Charlotte (2004). "Modelos de enfermedad del cáncer de mama". Descubrimiento de drogas hoy . 1 : 9-16. doi : 10.1016 / j.ddmod.2004.05.001 .
- ^ Hirata R, Chamberlain J, Dong R, Russell DW (julio de 2002). "Inserción de transgén dirigida en cromosomas humanos por vectores de virus adenoasociados". Nat. Biotechnol . 20 (7): 735–8. doi : 10.1038 / nbt0702-735 . PMID 12089561 .
- ^ Masters JR (diciembre de 2000). "Líneas celulares de cáncer humano: realidad y fantasía". Nat. Rev. Mol. Cell Biol . 1 (3): 233–6. doi : 10.1038 / 35043102 . PMID 11252900 .
- ^ Engelhardt JF (agosto de 2006). "AAV da en el blanco genómico". Nat. Biotechnol . 24 (8): 949–50. doi : 10.1038 / nbt0806-949 . PMID 16900138 .
- ^ a b Urnov, Fyodor D .; Rebar, Edward J .; Holmes, Michael C .; Zhang, H. Steve; Gregory, Philip D. (2010). "Edición del genoma con nucleasas de dedos de zinc diseñadas". Nature Reviews Genética . 11 (9): 636–646. doi : 10.1038 / nrg2842 . PMID 20717154 .
- ^ Radecke S, Radecke F, Cathomen T, Schwarz K (abril de 2010). "Reparación de genes inducida por nucleasa de dedo de zinc con oligodesoxinucleótidos: modificaciones del locus diana deseadas y no deseadas" . Mol. Ther . 18 (4): 743–53. doi : 10.1038 / mt.2009.304 . PMC 2862519 . PMID 20068556 .
Noticias
- Masters JR (diciembre de 2000). "Líneas celulares de cáncer humano: realidad y fantasía". Nat. Rev. Mol. Cell Biol . 1 (3): 233–6. doi : 10.1038 / 35043102 . PMID 11252900 .
- http://web.mit.edu/piyush/www/diseasemodels.pdf
- http://www.genengnews.com/gen-news-highlights/gsk-to-use-horizon-discovery-s-cell-lines-for-cancer-related-metabolomics-research/78565157/
- http://www.genomeweb.com/biotechtransferweek/horizon-discoverys-umb-cell-line-deal-latest-example-its-academic-collaboration-
- http://www.genomeweb.com/dxpgx/tgen-horizon-discovery-set-pgx-pact
- https://web.archive.org/web/20120420044126/http://www.tgen.org/news/index.cfm?pageid=57&newsid=1764 TD2
- http://www.businessweekly.co.uk/life-sciences-archive/horizon-hooks-up-with-genentech.html [ enlace muerto permanente ]
- https://web.archive.org/web/20110712220150/http://www.horizondiscovery.com/uploads/horizon-downloads/horizon-xman-genesis-faqs.pdf /
- http://www.cellectis.com/genome-engineering/meganucleases/engineered-meganucleases/meganuclease-technologies/ [ enlace muerto permanente ]
- http://www.sigmaaldrich.com/life-science/zinc-finger-nuclease-technology/custom-zfn.html
- https://web.archive.org/web/20101215173538/http://tools.invitrogen.com/content.cfm?pageid=3375
Fuentes
- Bardelli A, Parsons DW, Silliman N, et al. (Mayo de 2003). "Análisis mutacional del quinoma de tirosina en cánceres colorrectales". Ciencia . 300 (5621): 949. doi : 10.1126 / science.1082596 . PMID 12738854 .
- Kohli M, Rago C, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B (2004). "Métodos fáciles para generar knockouts de genes de células somáticas humanas utilizando virus adenoasociados recombinantes" . Ácidos nucleicos Res . 32 (1): 3e – 3. doi : 10.1093 / nar / gnh009 . PMC 373311 . PMID 14704360 .
- Wang Z, Shen D, Parsons DW y col. (Mayo de 2004). "Análisis mutacional del fosfatoma de tirosina en cánceres colorrectales". Ciencia . 304 (5674): 1164–6. doi : 10.1126 / science.1096096 . PMID 15155950 .
- Topaloglu O, Hurley PJ, Yildirim O, Civin CI, Bunz F (2005). "Métodos mejorados para la generación de líneas celulares knockout y knockin de genes humanos" . Ácidos nucleicos Res . 33 (18): e158. doi : 10.1093 / nar / gni160 . PMC 1255732 . PMID 16214806 .
- Moroni M, Sartore-Bianchi A, Benvenuti S, Artale S, Bardelli A, Siena S (noviembre de 2005). "Mutación somática del dominio catalítico EGFR y tratamiento con gefitinib en cáncer colorrectal" . Ana. Oncol . 16 (11): 1848–9. doi : 10.1093 / annonc / mdi356 . PMID 16012179 .
- Di Nicolantonio F, Bardelli A (enero de 2006). "Mutaciones de quinasa en cáncer: ¿grietas en la armadura del enemigo?". Curr Opin Oncol . 18 (1): 69–76. doi : 10.1097 / 01.cco.0000198020.91724.48 . PMID 16357567 .
- Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al. (Marzo de 2007). "La activación oncogénica de la vía de señalización RAS / RAF altera la respuesta de los cánceres colorrectales metastásicos a las terapias con anticuerpos del receptor del factor de crecimiento epidérmico" . Cancer Res . 67 (6): 2643–8. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-06-4158 . PMID 17363584 .
- Arena S, Pisacane A, Mazzone M, Comoglio PM, Bardelli A (julio de 2007). "Orientación genética de la actividad quinasa del receptor Met en células cancerosas" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 104 (27): 11412–7. doi : 10.1073 / pnas.0703205104 . PMC 2040912 . PMID 17595299 .
- Konishi H, Karakas B, Abukhdeir AM y col. (Septiembre de 2007). "Knock-in de K-ras mutante en células epiteliales humanas no tumorigénicas como un nuevo modelo para estudiar la transformación mediada por K-ras" . Cancer Res . 67 (18): 8460–7. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-07-0108 . PMID 17875684 .
- Arena S, Isella C, Martini M, de Marco A, Medico E, Bardelli A (septiembre de 2007). "Knock-in de Kras oncogénico no transforma las células somáticas de ratón, pero desencadena una respuesta transcripcional que clasifica los cánceres humanos" . Cancer Res . 67 (18): 8468–76. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-07-1126 . PMID 17875685 .
- Grim JE, Gustafson MP, Hirata RK, et al. (Junio de 2008). "Degradación de sustrato dependiente del ciclo celular y de isoformas por la ubiquitina ligasa Fbw7" . J. Cell Biol . 181 (6): 913-20. doi : 10.1083 / jcb.200802076 . PMC 2426948 . PMID 18559665 .
- Fattah FJ, Lichter NF, Fattah KR, Oh S, Hendrickson EA (junio de 2008). "Ku70, un gen esencial, modula la frecuencia de direccionamiento de genes mediado por rAAV en células somáticas humanas" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 105 (25): 8703–8. doi : 10.1073 / pnas.0712060105 . PMC 2438404 . PMID 18562296 .
- Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, et al. (Diciembre de 2008). "Se requiere BRAF de tipo salvaje para la respuesta a panitumumab o cetuximab en cáncer colorrectal metastásico" . J. Clin. Oncol . 26 (35): 5705-12. doi : 10.1200 / JCO.2008.18.0786 . hdl : 2434/349662 . PMID 19001320 . Archivado desde el original el 15 de abril de 2013.
- Di Nicolantonio F, Arena S, Gallicchio M, et al. (Diciembre de 2008). "Reemplazo de alelos normales con mutantes en el genoma de células humanas normales revela respuestas a fármacos específicas de mutación" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 105 (52): 20864–9. doi : 10.1073 / pnas.0808757105 . PMC 2634925 . PMID 19106301 .
- Gustin JP, Karakas B, Weiss MB y col. (Febrero de 2009). "Knockin del mutante PIK3CA activa múltiples vías oncogénicas" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 106 (8): 2835–40. doi : 10.1073 / pnas.0813351106 . PMC 2636736 . PMID 19196980 .
- Sartore-Bianchi A, Martini M, Molinari F, et al. (Marzo de 2009). "Las mutaciones de PIK3CA en el cáncer colorrectal están asociadas con la resistencia clínica a los anticuerpos monoclonales dirigidos a EGFR" . Cancer Res . 69 (5): 1851–7. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-08-2466 . PMID 19223544 .
- Sur S, Pagliarini R, Bunz F, et al. (Marzo de 2009). "Un panel de células cancerosas humanas isogénicas sugiere un enfoque terapéutico para cánceres con p53 inactivado" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 106 (10): 3964–9. doi : 10.1073 / pnas.0813333106 . PMC 2656188 . PMID 19225112 .
- Yun J, Rago C, Cheong I y col. (Septiembre de 2009). "La privación de glucosa contribuye al desarrollo de mutaciones de la vía KRAS en células tumorales" . Ciencia . 325 (5947): 1555–9. doi : 10.1126 / science.1174229 . PMC 2820374 . PMID 19661383 .
- Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, Nichelatti M, et al. (2009). Cordes N (ed.). "Análisis de múltiples determinantes de alteraciones moleculares para predecir el beneficio clínico de los anticuerpos monoclonales dirigidos a EGFR en el cáncer colorrectal" . PLoS ONE . 4 (10): e7287. doi : 10.1371 / journal.pone.0007287 . PMC 2750753 . PMID 19806185 .
- La expresión endógena de la mutación de PI3K oncogénica conduce a la señalización de PI3K activada y un póster de fenotipo invasivo presentado en AACR / EORTC Molecular Targets and Cancer Therapeutics, Boston, EE. UU., Noviembre de 2009
- Bardelli A, Siena S (marzo de 2010). "Mecanismos moleculares de resistencia a cetuximab y panitumumab en cáncer colorrectal" . J. Clin. Oncol . 28 (7): 1254–61. doi : 10.1200 / JCO.2009.24.6116 . PMID 20100961 . Archivado desde el original el 15 de abril de 2013.
- Fattah F, Lee EH, Weisensel N, Wang Y, Lichter N, Hendrickson EA (febrero de 2010). Pearson CE (ed.). "Ku regula la elección de la vía de unión del extremo no homólogo de la reparación de rotura de doble hebra del ADN en células somáticas humanas" . PLoS Genet . 6 (2): e1000855. doi : 10.1371 / journal.pgen.1000855 . PMC 2829059 . PMID 20195511 .
- Buron N, Porceddu M, Brabant M, et al. (2010). Aziz SA (ed.). "Uso de mitocondrias de líneas celulares de cáncer humano para explorar los mecanismos de los péptidos BH3 y la permeabilización de la membrana mitocondrial inducida por ABT-737" . PLoS ONE . 5 (3): e9924. doi : 10.1371 / journal.pone.0009924 . PMC 2847598 . PMID 20360986 .
- Expresión endógena de la mutación oncogénica de PI3K conduce a la acumulación de proteínas antiapoptóticas en las mitocondrias Póster presentado en AACR 2010, Washington, DC, EE. UU., Abril. 2010
- El uso de líneas celulares isogénicas 'X-MAN' para definir los perfiles de actividad del inhibidor de la PI3-quinasa Póster Presentado en AACR 2010, Washington, DC, EE. UU., Abril. 2010
- El uso de PI3CA mutante 'X-MAN' aumenta la expresión de isoformas de tubulina individuales y promueve la resistencia a los fármacos antimitóticos de quimioterapia. Póster presentado en AACR 2010, Washington, DC, EE. UU., Abril. 2010
- Di Nicolantonio F, Arena S, Tabernero J, et al. (Agosto de 2010). "La desregulación de las vías de señalización de PI3K y KRAS en las células cancerosas humanas determina su respuesta al everolimus" . J. Clin. Invertir . 120 (8): 2858–66. doi : 10.1172 / JCI37539 . PMC 2912177 . PMID 20664172 .