En genética , la recombinación Flp- FRT es una tecnología de recombinación dirigida al sitio , cada vez más utilizada para manipular el ADN de un organismo en condiciones controladas in vivo . Es análogo a Cre- lox recombinación , sino que implica la recombinación de secuencias entre objetivo reconocimiento corto flipasa ( FRT ) sitios por la recombinasa flipasa ( Flp ) derivado de la 2 μ plásmido de levadura de panadero Saccharomyces cerevisiae .
Recombinasa específica de sitio Flp | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | FLP1 | |||||
UniProt | P03870 | |||||
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![Mecanismo simplificado de recombinasa Flp-FRT.png](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/9/95/Simplified_Flp-FRT_Recombinase_Mechanism.png/220px-Simplified_Flp-FRT_Recombinase_Mechanism.png)
La secuencia mínima del sitio FRT de 34 pb tiene la secuencia
- 5 'GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC3 '
para lo cual la flippasa (Flp) se une a ambos brazos 5'-GAAGTTCCTATTC-3 'de 13 pb que flanquean el espaciador de 8 pb, es decir, la recombinación específica del sitio (región de cruce) en orientación inversa. La escisión mediada por FRT se produce justo antes de la región central asimétrica de 8 pb ( 5 'tctagaaa3 ' ) en la hebra superior y detrás de esta secuencia en la hebra inferior. [1] Varios variante FRT existen sitios, pero la recombinación por lo general sólo pueden ocurrir entre dos idénticos FRT s pero generalmente no entre no idéntico ( "heterospecific") FRT s. [2] [3]
Función biológica
En la levadura, esta enzima corrige las disminuciones en el número de copias de plásmido de 2 µ causadas por raros eventos de mala segregación. Lo hace provocando la recombinación entre las dos repeticiones invertidas en el plásmido de 2 µ durante la replicación del ADN . Esto cambia la dirección de una bifurcación de replicación, provocando múltiples rondas de copia en una sola iniciación. [4]
Mutaciones de la secuencia del sitio FRT
Senecoff y col. (1987) investigaron cómo las sustituciones de nucleótidos dentro del FRT afectaron la eficacia de la recombinación mediada por FLP. Los autores indujeron sustituciones de bases en uno o ambos sitios FRT y probaron la concentración de FLP requerida para observar recombinaciones específicas del sitio. Cada sustitución de bases se realizó en cada uno de los trece nucleótidos dentro del sitio FRT (ejemplo G a A, T y C). Primero, los autores demostraron que la mayoría de las mutaciones dentro de la secuencia FRT causan efectos mínimos si están presentes en solo uno de los dos sitios. Si se produjeron mutaciones en ambos sitios, la eficacia de FLP se reduce drásticamente. En segundo lugar, los autores proporcionaron datos para los cuales los nucleótidos son más cruciales para la unión de FLP y la eficacia de la recombinación específica del sitio. Si el primer nucleótido en ambos sitios FRT se sustituye por una citosina (G a C), el tercer nucleótido se sustituye por una timina (A a T), o el séptimo nucleótido se sustituye por una adenosina (G a A), entonces el la eficacia de la recombinación específica de sitio mediada por FLP se reduce más de 100 veces. [5] Mientras que una sustitución de base de cualquiera de los nucleótidos antes mencionados en solo uno de los sitios FRT condujo a una reducción de la eficacia de diez, diez y cinco veces, respectivamente. [5]
Las sustituciones de bases en los nucleótidos en mayúsculas condujeron a la mayor reducción en la recombinación específica de sitio mediada por FLP (mutante x tipo salvaje y mutante x mutante):
- 5 'GaAtagGaacttc3 ' [5]
Muchas construcciones disponibles incluyen secuencias de brazos adicionales (5'-GAAGTTCCTATTCC-3 ') un par de bases alejado del elemento aguas arriba y en la misma orientación:
- 5 'GAAGTTCCTATTC c GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC3 '
Este segmento es prescindible para la escisión, pero es esencial para la integración, incluido el intercambio de casetes mediado por recombinasa . [6]
Debido a que la actividad de recombinación se puede dirigir a un órgano seleccionado, o se puede usar un nivel bajo de actividad de recombinación para alterar consistentemente el ADN de solo un subconjunto de células, se puede usar Flp- FRT para construir mosaicos genéticos en organismos multicelulares. Con esta tecnología , se puede estudiar la pérdida o alteración de un gen en un determinado órgano diana de interés, incluso en los casos en que los animales de experimentación no sobrevivirían a la pérdida de este gen en otros órganos ( control espacial ). El efecto de alterar un gen también se puede estudiar a lo largo del tiempo, utilizando un promotor inducible para desencadenar la actividad de recombinación en una etapa tardía del desarrollo ( control temporal ), lo que evita la alteración.
Estructura bioquímica de Flp y mecanismo de acción.
Estructura y sitio activo bioquímicamente relevantes
La proteína Flp, al igual que Cre, es una recombinasa específica del sitio de la familia de tirosina. [7] Esta familia de recombinasas realiza su función a través de un mecanismo de topoisomerasa de tipo IB que provoca la recombinación de dos cadenas separadas de ADN. [7] La recombinación se lleva a cabo mediante un proceso repetido de dos pasos. El paso inicial provoca la creación de un cruce intermedio de Holliday . El segundo paso promueve la recombinación resultante de las dos cadenas complementarias. Como sugiere su apellido, un nucleófilo de tirosina altamente conservado escinde las hebras de ADN. [7] Las propiedades nucleofílicas de la tirosina atacan y se unen al 3'-fosfato en el punto de escisión del ADN. [7] El grupo 5'-hidroxilo resultante del ADN escindido actúa como nucleófilo y ataca al 3'-fosfato en la hebra de ADN escindida de forma complementaria, lo que da como resultado una recombinación exitosa. [7] Fuera del residuo de tirosina, hay una pentada catalítica conservada. Esta pentada está compuesta por una lisina (Lysβ), dos argininas (Arg I y II), una histidina (His-II) y una histidina / triptófano (His / Trp-III) que comprende una constelación obligatoria y altamente conservada de residuos para el sitio activo de Flp y Cre (junto con otras topiosomerasas de IB). [7] Estos otros residuos son cruciales para la correcta orientación de la unión y posicionamiento de Flp en las cadenas de ADN.
Aplicación de recombinación específica de sitio mediada por FLP
Problemas iniciales
Termolabilidad
La aplicación inicial de la recombinasa FLP-FRT no funcionó en mamíferos. La proteína FLP era termolábil (desnaturalizada a temperaturas elevadas) y por lo tanto no fue útil en el modelo de mamíferos debido a las temperaturas corporales elevadas de estos sistemas modelo. Sin embargo, debido a las patentes y las restricciones sobre el uso de la recombinación Cre-Lox, se tomó gran interés en producir un casete FLP-FRT más termoestable. Algunos de los primeros resultados fueron producidos por Buchholz et al. (1997) utilizando mutagénesis cíclica en Escherichia coli . En su investigación, los autores transfectaron células de E. coli con dos plásmidos: uno que codifica proteínas FLP mutadas aleatoriamente aguas abajo de un promotor de arabinosa y otro que contiene un promotor del gen lacZ dentro de un casete FRT. Las E. coli se cultivaron en placas de arabinosa a 37 ° C y 40 ° C, y si se producía la recombinación, la expresión de lacZ se atenuaría y las colonias aparecerían blancas. Se seleccionaron colonias blancas de cada generación y se cultivaron en nuevas placas de arabinosa a las mismas temperaturas anteriores durante ocho generaciones. [8] Después de la recombinación fue confirmada por genes de FLP transferencia de Western y la mutados fueron secuenciados, este e ighth generación FLP proteína (FLPe) se transfectó en cultivos celulares de mamíferos, y se confirmó la recombinación en células de mamífero. [8] Esta variante de FLP solo tiene 4 sustituciones de aminoácidos: P2S, L33S, Y108N y S294P.
Generación de mosaicos genéticos
El mosaicismo genético ocurre dentro de un organismo cuando tipos de células similares expresan fenotipos diferentes debido a genotipos diferentes en loci específicos. En pocas palabras, esto ocurre cuando un organismo contiene diferentes genotipos, lo que suele ser raro en la naturaleza. Sin embargo, esto se puede producir fácilmente (y de manera problemática) usando la recombinación FLP-FRT. Si dos sitios FRT diferentes están presentes dentro de una célula, y FLP está presente en concentraciones apropiadas, el casete FRT continuará siendo escindido e insertado entre los dos sitios FRT. Este proceso continuará hasta que las proteínas FLP caigan por debajo de las concentraciones requeridas dando como resultado que las células dentro de un organismo posean diferentes genotipos. [9] Esto se ha observado desde moscas de la fruta hasta ratones y es indiscriminado contra cromosomas específicos (somáticos y sexuales) o tipos celulares (somáticos y de línea germinal). [9] [10]
Determinación de linajes celulares.
Antes de la publicación de Dymecki et al . (1998), la recombinasa Cre se había utilizado para el mapeo del destino celular de los progenitores neuronales en ratones utilizando el promotor En2 . [11] Así, los autores de Dymecki et al . (1998) teorizaron que la FLP recombinasa podría utilizarse de una manera similar con una eficacia similar a la Cre recombinasa en ratones. Los autores crearon dos líneas de ratones transgénicos: una línea de fusión neuronal Wnt1 :: Flp y una línea que poseía el casete FRT que flanqueaba el exón 18 de tm1Cwr . [9] Los autores eligieron este exón para la escisión porque si se extirpa, da como resultado un fenotipo nulo. Los autores emparejaron las dos líneas y permitieron que la progenie alcanzara la edad adulta antes de que la progenie fuera sacrificada. La extracción de ARN se realizó en tejido neuronal, muscular, entérico y de la cola. La PCR de transcripción inversa y la transferencia Northern confirmaron la escisión del exón 18 de tm1Cwr abundantemente en el tejido cerebral y moderadamente en el tejido muscular (debido a las células de Scwhann dentro del músculo). Como era de esperar, no se observó la escisión en otros tejidos. Los autores vieron una eficiencia igual, si no mejor, de la recombinasa FLP en la determinación del destino celular que la recombinasa Cre.
En Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)
Hasta la fecha, la recombinasa Flp se ha utilizado muchas veces en D. melanogaster. Frickenhaus et al. Publicaron una comparación de la recombinasa Flp con la recombinasa Cre en D. melanogaster . (2015) [12] . Los autores de Frickenhaus et al. (2015) tenía un doble objetivo: caracterizar y comparar la eficacia del "knock-out" de la recombinasa de Flp con el "knock-out" de la recombinasa de Cre y el knockdown de RNAi y revelar la función de cabeza (caz), el ortólogo de mosca para FUS , en las neuronas y tejido muscular de D. melanogaster . El FUS ha estado fuertemente implicado en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal en humanos [12] . Los autores utilizaron un sistema elav - Gal4 / UAS -Flp o Cre para expresar la recombinasa específicamente en neuronas y un sistema Mef2 -Gal4 / UAS-Flp o Cre para expresarla específicamente en músculos. [12] Los autores concluyen que la herramienta de "eliminación" de la recombinasa Flp es más eficaz que la recombinasa RNAi y Cre con el fin de eliminar genes específicos en tejidos o líneas celulares específicos debido a la falta de expresión con fugas observada en ambos la proteína Cre y la transcripción de ARNi. Además, los autores presenciaron una toxicidad de la proteína Cre que no se observa con la proteína Flp. [12]
En Danio rerio (pez cebra)
La eficacia del sistema de recombinasa FLPe fue evaluada en pez cebra por Wong et al . (2009). [13] A los embriones, que eran hemicigóticos para una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) flanqueada por FRT aguas abajo de un promotor específico de músculo, se les inyectó la proteína FLPe. Sin FLPe, estos embriones deberían expresar EGFP en todo el tejido muscular y, si se cruzan con una hebra de tipo salvaje, el 50% de la progenie resultante también debería expresar EGFP en el tejido muscular. Los embriones, inyectados con FLPe, habían reducido significativamente la expresión de EGFP en el tejido muscular, y también se observó mosaicismo. [13] Cuando estos embriones alcanzaron la edad adulta, se aparearon con una cepa de tipo salvaje, y las nidadas resultantes tenían una descendencia significativamente menor que expresaba EGFP en el tejido muscular (0-4%). [13] Estos resultados muestran que FLPe no solo es muy eficaz en las células somáticas, sino que también es muy eficaz en la línea germinal del pez cebra.
En plantas
Creación de "fitosensores" o "centinelas" en Arabidopsis thaliana y Tabaco
Los fitosensores son plantas modificadas genéticamente que pueden informar la presencia de contaminantes bióticos o abióticos. [14] Obviamente, la producción de estas plantas de ingeniería tiene una gran promesa agrícola y de laboratorio. Sin embargo, se ha demostrado que crear un vector indicador apropiado es problemático. Los elementos reguladores cis juegan un papel importante en la activación transcripcional de genes en plantas, y muchos no se comprenden bien. Muchos fitosensores sub-expresan sus genes reporteros o reportan falsos positivos debido a promotores sintéticos. [14] Los autores de Rao et al. (2010) utilizaron la herramienta FLP recombinasa para la producción de fitosensores altamente eficientes. Los autores utilizaron un promotor de choque térmico para inducir la producción de FLP, mientras que un vector flanqueado por FRT separó el promotor CaMV 35S del gen de la beta-glucuronidasa (GUS). Cuando las plantas se expusieron a un choque térmico, la inducción de FLP condujo a la escisión del vector flanqueado por FRT, moviendo efectivamente el gen GUS directamente corriente abajo del promotor CaMV 35S. La activación de GUS llevó a que las hojas de las plantas cambiaran de verde a azul; por lo tanto, el fitosensor informó efectivamente sobre el estrés al sistema modelo. [14]
Con Cre-recombinasa
Producción del sistema de expresión inducible MiARN listo para la puerta de entrada (GRIM)
La interferencia de ARN (ARNi) ha provocado un cambio de paradigma en la expresión de genes y posibles eliminaciones genéticas en eucariotas. Antes de la producción del sistema de expresión GRIM, la creación de vectores de ARNi era costosa y requería mucho tiempo. Los vectores se produjeron mediante el método tradicional de clonación molecular de copiar y pegar. [15] Garwick-Coppens y col . (2011) desarrollaron un método mucho más eficiente para la producción de vectores de ARNi en el que la expresión de ARNi puede inutilizarse usando Cre-recombinasa y eliminarse usando Flp-recombinasa. El novedoso sistema de expresión GRIM permite una generación mucho más rápida de vectores de expresión que contienen construcciones artificiales de ARNi. [15] Los autores continuaron demostrando que su sistema de expresión funciona con bastante eficacia en las células de los riñones embrionarios humanos (HEK), una línea celular inmortalizada humana común en la investigación molecular.
Ver también
- Tecnología de recombinasa específica del sitio
- Intercambio de casetes mediado por recombinasa
- Cre recombinasa
- Recombinación Cre-Lox
- Recombinación genética
- Recombinación homóloga
Referencias
- ^ Zhu XD, Sadowski PD (septiembre de 1995). "Ligadura dependiente de escisión por la recombinasa FLP. Caracterización de una proteína FLP mutante con una alteración en un aminoácido catalítico" . La revista de química biológica . 270 (39): 23044–54. doi : 10.1074 / jbc.270.39.23044 . PMID 7559444 .
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enlaces externos
- Recombinase Flp-FRT: mecanismo de acción
- Video de la utilización de la recombinasa Flp-FRT en el fotorreceptor de D. melanoster
- Aplicación de FLP en la mutagénesis de Vibrio cholerae