kaiA es un gen del grupo de genes "kaiABC" que desempeña un papel crucial en la regulación de los ritmos circadianos bacterianos , como en la cianobacteria Synechococcus elongatus . [1] Para estas bacterias, la regulación de la expresión de kaiA es fundamental para el ritmo circadiano, que determina el ritmo biológico de veinticuatro horas. Además, KaiA funciona con un circuito de retroalimentación negativa en relación con kaiB y KaiC . El gen kaiA produce la proteína KaiA que mejora la fosforilación de KaiC mientras que KaiB inhibe la actividad de KaiA. [2]
Historia
Descubrimiento
Se han descubierto ritmos circadianos en una diversidad de organismos. [3] Estos ritmos controlan una variedad de actividades fisiológicas y ayudan a los organismos a adaptarse a las condiciones ambientales. [3] Las cianobacterias son los organismos más primitivos que demuestran una oscilación circadiana. [3] Los relojes de cianobacterias se fundaron por primera vez en algas verdiazules con los fósiles más antiguos conocidos de unos 3.500 millones de años. Susan Golden , Carl H. Johnson y Takao Kondo fueron los individuos que encontraron que el reloj mínimo de cianobacterias consta de 3 proteínas: KaiA, KaiB y KaiC. [3] (Nota: kai significa ciclo en japonés). [4] El experimento realizado por Kondo consistió en unir el gen de la luciferasa y realizar mutagénesis. Esta fue la primera identificación de posibles genes que podrían reconstituir un reloj biológico dentro de las cianobacterias, de las cuales se incluyó KaiA. [5]
Las cianobacterias fueron las primeras procariotas que se informó que tenían un reloj circadiano. [6] Para la adaptación de las cianobacterias, los genes del reloj circadiano exhiben formas de gran importancia, ya que regulan procesos físicos fundamentales como la regulación de la fijación de nitrógeno, la división celular y la fotosíntesis . [6] Las primeras investigaciones de KaiA se realizaron en el artículo de investigación de 1998, "Expresión de un grupo de genes kaiABC como un proceso de retroalimentación circadiana en cianobacterias", donde detalla las funciones del grupo de genes y KaiA en el sentido de que sostiene las oscilaciones al mejorar Kai Expresión C. KaiA se descubrió mientras estudiaba las mutaciones del reloj en Synechococcus mediante el uso de la bacteria luciferasa como informadora de la expresión génica controlada por reloj. Esta fue la primera vez que los científicos propusieron por primera vez un mecanismo y un sistema de nombres para KaiA y el grupo de genes kaiABC. [4]
Investigación notable
Los investigadores Masato Nakajima, Keiko Imai, Hiroshi Ito, Taeko Nishiwaki, Yoriko Murayama, Hideo Iwasaki, Tokitaka Oyama y Takao Kondo llevaron a cabo el experimento "Reconstitución de la oscilación circadiana de la fosforilación de cianobacterias KaiC en vitro" tomaron KaiA, KaiC y las pusieron en tubo con ATP, MgCl2 y tampones solamente. [7] Usaron ATP radioactivo y la forma fosforilada de KaiC que corre un poco más rápido que KaiC sin fosforilar. Vieron un ritmo de veinticuatro horas en la autohidrolización de KaiC. El sistema también tiene compensación de temperatura y fue digno de mención porque solo necesitaban tres proteínas, incluida KaiA, para un ritmo de veinticuatro horas.
La investigación publicada en el artículo, "Ritmos circadianos robustos y sintonizables de dominios catalíticos diferenciales sensibles", realizada por Connie Phong, Joseph S. Markson, Crystal M. Wilhoite y Michael J. Rust, muestra la relación matemática de KaiA y KaiC donde KaiA estimula la fosforilación de KaiC. Además, KaiB secuestra KaiA, que promueve la desfosforilación de KaiC. [8]
Además, "Regulación in vitro del ritmo de fosforilación circadiano de la proteína del reloj cianobacteriano KaiC, KaiA y KaiB", muestra el mecanismo de arrastre del reloj circadiano celular con el ritmo circadiano en respuesta a los niveles intracelulares de KaiA y las otras proteínas Kai. [9] Las proporciones de KaiA a KaiB y KaiC expresan un ritmo circadiano y guían la fosforilación de KaiC en función de las proporciones de KaiA que pueden incorporarse en diferentes condiciones de luz y oscuridad.
Historia evolutiva
Las cianobacterias fueron uno de los organismos más antiguos de la tierra y de mayor éxito en cuanto a plasticidad y adaptabilidad ecológica. [6] Dvornyk realizó un análisis filogenético de los genes kai y descubrió que los genes kai tienen diferentes historias evolutivas; el ciclo de retroalimentación en el que se encuentra kaiA evolucionó alrededor de 1000 Mya. [6] Una cantidad mínima de genes kaiA prohíbe una datación completa de su evolución. [6] Dado que se encuentran solo en algunas cianobacterias superiores, los genes kaiA son los más jóvenes en comparación con kaiB y kaiC, evolutivamente hablando. [6] Synechococcus sp. PCC7942 tiene kaiA mientras que P. marinus no, a pesar de que son organismos unicelulares estrechamente relacionados, lo que demuestra aún más la juventud evolutiva del gen kaiA. [6] Los genes KaiA también se encuentran en los genomas de las especies del subárbol kaiC, en clados más jóvenes que Prochlorococcus . [6] Por lo tanto, los genes kaiA probablemente llegaron después de la especiación de Synechococcus y Prochlorococcus , alrededor de 1.051 ± 1,16.9 y 944 ± 92.9 Mya. [6]
Los genes KaiA se localizan solo en cianobacterias con una longitud que va desde una cianobacteria filamentosa ( Anabaena y Nostoc ) hasta cianobacterias unicelulares ( Synechoccus y Synechocyti s), que son 852-900 pb más largas. [6] Los genes KaiA son los menos conservados entre los genes kai. [6] Los homólogos más cortos de los genes kaiA y kaiB coinciden sólo con 1 segmento de sus versiones más largas más cerca del extremo 3 ', a diferencia de los genes kaiC. Esto implica que kaiA y kaiB probablemente no evolucionaron a través de la duplicación. [6] Específicamente, el gen kaiA solo tenía una copia. [6]
Genética y estructura proteica
Estadísticas de KaiA: 284 aminoácidos; [4] Masa molecular de 32,6 kD; [4] Punto isoeléctrico de 4,69. [4]
Las proteínas Kai no comparten una secuencia similar a ninguna proteína de reloj eucariota, aunque los procesos fundamentales se parecen a los de los organismos eucariotas (como la fase de reajuste de la luz, la compensación de temperatura, el período de funcionamiento sin anuncios). [10] Los genes Kai se encuentran en casi todas las cianobacterias. [10] Williams descubrió que 6 de los genomas de cianobacterias anotados tenían 2 ORF contiguos que mantenían la homología con los genes kaiB y kaiC alargados de S. [10] De estas asociaciones de secuencias, solo cuatro genes kaiA son distinguibles, por lo que es la secuencia más diversificada de los genes kai. [10] El Synechocystis sp. El genoma de la cepa PCC 6803 tiene solo un gen kaiA, mientras que se encuentran múltiples en kaiB y kaiC. [10] Los homólogos de KaiB y kaiC se pueden encontrar en otras eubacterias y arqueas, pero parece que kaiA solo se encuentra en cianobacterias (actualmente los únicos procariotas con oscilación biológica de 24 horas). [10]
KaiA Tres dominios funcionales:
1) Dominio N-terminal (amplificador de amplitud) [11]
2) Dominio del ajustador de período central [11]
3) Dominio del oscilador de reloj del terminal C [11]
El dominio C-terminal ayuda a la formación de dímeros, lo que permite que KaiA se una a KaiC. Esto mejora aún más la fosforilación de KaiC. [11] (ver funciones a continuación)
En el centro de la porción cóncava de KaiA se encuentra el residuo His270, que es esencial para la función de KaiA. [11]
Mutaciones
Hay 3 mutaciones de 19 mutantes (sustituciones de un solo amino) que se encuentran en kaiA y que se encuentran a partir de la secuenciación directa del grupo. [4] Por lo tanto, tanto el grupo como las proteínas Kai tienen funciones necesarias para el reloj circadiano de Synechococcus . [4] La sobreexpresión de kaiA inducida por IPTG provocó arritmicidad, lo que demuestra que la ritmicidad requiere la expresión de kaiA así como de otros genes. [4] La mutagénesis de kaiA revela que rara vez hay mutaciones de período corto, sino una abundancia de mutaciones de período largo. [3] Específicamente, Nishimura encontró que hay 301 mutaciones de período largo, 92 mutantes arrítmicos y solo una mutación de período corto. [3] Por lo tanto, Nishimura concluyó que las mutaciones kaiA generalmente conducen a una extensión del período. [3] Una excepción sería el mutante F224S en el que se encontró un período corto de 22 h en KaiA. [3] Los períodos mutantes KaiA variaron hasta 50 h en los que algunos mutantes demostraron arritmicidad. [3] Las mutaciones de KaiA parecen alterar selectivamente la duración del período, lo que demuestra que kaiA puede regular el período. [3] Además, las proteínas kaiA pueden regular la duración de un período de oscilación circadiana independientemente de si kaiBC se activó o no. [3] Los períodos prolongados fueron causados por mutaciones dentro de kaiA, así como por la disminución de la expresión de kaiBC. [3]
Se ha descubierto que KaiA mejora la expresión de kaiBC. [4] Se postula que ciertas proteínas kaiA mutantes no lograron mantener la ritmicidad debido a la falta de activación de la expresión de kaiBC. [3] Nishimura descubrió que la mayoría de las mutaciones de KaiA disminuían la actividad de PkaiBC a diferentes niveles. [3] Esto es consistente con el hallazgo de que las proteínas kaiA mejoran la actividad kaiBC. [3] Su experimento sugirió además que kaiA es parte del mecanismo de reajuste de fase del reloj de las cianobacterias. [3] Las mutaciones que se asignaron a las regiones del grupo de kaiA condujeron a fenotipos de período largo, lo que sugiere que las regiones del grupo kaiA desempeñan un papel en la regulación de la duración del período de la oscilación circadiana. Es muy probable que las regiones de KaiA que aumentan la expresión de kaiBC (permitiendo el ritmo) no se encuentren en regiones de clúster porque los mutantes arrítmicos (C53S, V76A, F178S, F224S, F274K) se mapearon en diferentes partes de kaiA. [3] Williams postuló que el KaiA135N es un dominio pseudo-receptor, es un dispositivo de entrada de tiempo que controla la estimulación KaiA de la autofosforilación de KaiC, por lo que es crucial para la oscilación circadiana. [10]
Tipos de proteínas KaiA
Parece haber tipos largos y cortos de proteínas kaiA. [10] El tipo largo, recolectado de S.elongatus , Synechocystis sp. Cepa PCC 5803 y Synechococcus sp. La cepa WH8108 tiene aproximadamente 300 residuos de aminoacilo. [10] Se observa un alto grado de conservación en los 100 residuos del carboxilo terminal. [10] Los dominios carboxilo-terminales independientes son las versiones cortas, de la especie filamentosa Anabaena sp. Cepa PCC 7120 y Nostoc punctiforme . [10] Hay dos dominios plegados independientemente de la proteína kaiA: KaiA180C (amino terminal con una estructura principalmente de hélice alfa) y dominio KaiA189N (dominio carboxilo terminal, correspondiente a los residuos 1-189). [10] La proteína S. alarga kaiA parece tener dos dominios, las regiones amino y carboxilo, conectados por un enlazador helicoidal de aproximadamente 50 residuos. [10]
Función
Las cianobacterias muestran un sistema de reloj circadiano en el que tres osciladores de proteínas, KaiA, KaiB y KaiC, constituyen un sistema conocido como oscilador postraduccional (PTO) que facilita la oscilación del bucle de retroalimentación negativa de traducción de transcripción (TTFL) más grande. [12] El TTFL impulsa la expresión génica y repone KaiA, KaiB y KaiC, mientras que el PTO constituye el núcleo del reloj circadiano de las cianobacterias. [12] Este núcleo de Kai confiere ritmicidad circadiana a la actividad de hidrólisis de ATP y la actividad de quinasa / fosfatasa , [13] ambas con compensación de temperatura. [14] Además, KaiB y KaiC, pero no KaiA, tienen un ritmo circadiano de 24 horas en condiciones experimentales, como el funcionamiento libre en condiciones de luz constante. [12]
Oscilación de fosforilación
Las proteínas Kai que componen la PTO generan un reloj circadiano de fosforilación / desfosforilación oscilante con un período de alrededor de 24 horas. [2] La proteína KaiC es una enzima con dos sitios de fosforilación específicos, treonina 432 y serina 431, que expresan ritmicidad en la fosforilación / desfosforilación, dependiendo de la actividad de KaiA y KaiB. [12] KaiA estimula la fosforilación de KaiC hasta que KaiB secuestra KaiA, iniciando la desfosforilación en una secuencia determinada en Treonina 432 y Serina 431: KaiA estimula la autofosforilación por KaiC en Treonina 432, y la Serina 431 sigue este mecanismo de fosforilación. [2] Cuando tanto la treonina 432 como la serina 431 están fosforiladas, KaiB se une a KaiC y este complejo, KaiBC, procede a bloquear el efecto de KaiA. [2] KaiB solo puede realizar esta acción de secuestro cuando KaiA está presente, y cuando esta acción ocurre, KaiA no puede activar KaiC para autofosforilar. [2] La treonina 432 se desfosforila primero, seguida de la desfosforilación de la serina 431, momento en el que KaiA estimula la fosforilación de los sitios KaiC y el sistema oscilante comienza de nuevo. [12]
Oscilación de ATPasa
Esta oscilación circadiana que involucra la actividad quinasa y fosfatasa ocurre en relación directa con la actividad ATPasa . [15] En las fases iniciales de la oscilación cuando KaiC no forma complejos con KaiA o KaiB, la tasa intrínseca y constante de hidrólisis de ATP controla los niveles de ATP. KaiA y KaiC se unen, formando el complejo KaiAC, que estimula la autofosforilación de KaiC. [2] Esta fosforilación resultante estimula la hidrólisis de ATP. [15] La proteína KaiC luego alcanza un estado de hiperfosforilación, después de esta unión de KaiA. En este punto de hiperfosforilación, KaiB se une a KaiC y se produce una inhibición de la hidrólisis de ATP. [15] KaiC luego regresa al estado inicial sin complejos, y las tasas de hidrólisis de ATP se estabilizan una vez más a la tasa intrínseca. [15]
Interacción KaiA y KaiC
Las proteínas difieren en sus dominios terminales C, sin embargo, ambos extremos facilitan la interacción entre las proteínas. [2] El dominio C terminal de KaiA permite la dimerización, formando una superficie cóncava que luego interactúa con el dominio C-terminal de KaiC. [2] Estos dominios C-terminales vecinos de un bucle en horquilla , o el A-loop, que en conjunto confieren interés: cuando una mutación da como resultado la pérdida tanto del dominio de la cola A como del C-terminal, el C-terminal puede permanecer fosforilado. en ausencia de KaiA, lo que indica que una posible función del bucle A es ayudar en la autofosforilación y autodefosforilación de KaiC. [2]
KaiC tiene 2 dominios de unión C-terminales: la región CI tiene el dominio de unión KaiA de CKABD1; La región CII tiene el dominio de unión KaiA de CKABD2. [16] El dominio C-terminal CII de KaiC mantiene la función de quinasa y fosfatasa que están reguladas por kaiA. [8] KaiA interactúa con este dominio que forma un bucle inhibidor, estimulando la actividad quinasa CII e iniciando la fosforilación de Ser431 y Thr432, dos residuos CII adyacentes. [8] La unión de KaiC y KaiA conduce a la descomposición de KaiA en un bucle A, aumentando así el movimiento de la región del bucle P, la región del bucle que contiene Thr-432 y Ser-431, y ATP. [12] El desplazamiento del bucle A permite la liberación de bucles adyacentes, promoviendo aún más la fosforilación de KaiC por KaiA. La evidencia de esto se muestra a través de la demostración de que un dímero KaiA es capaz de empujar KaiC a un estado hiperfosforilado. [12] Los dímeros KaiA exhiben una asociación del 95% con los hexámeros KaiC, en los que más dímeros kaiA participan en la interacción con kaiC. [16] La interacción entre KaiA y KaiC no es, por tanto, una interacción 1: 1. [16] Los dímeros de KaiA probablemente se asocian y disocian de manera flexible con los dímeros de KaiC en lugar de formar un complejo estable, lo que permite que todas las subunidades de KaiC se fosforilen en el ciclo de fosforilación de Kai. [dieciséis]
Modelo complejante
Las imágenes bioquímicas revelaron el montaje y desmontaje de varios complejos de Kai que se forman durante las oscilaciones del reloj circadiano. [12] Durante el proceso, KaiA y KaiB se unen a sitios en KaiC; el modelo determina que KaiC luego se convierte en KaiAC cuando KaiA estimula la autofosforilación, que luego se transforma en KaiBC, KaiABC, [17] y luego regresa a KaiC a medida que el ciclo continúa. [2]
Modelos hipotetizados
"Las cianobacterias son los organismos más simples conocidos por exhibir ritmos circadianos". [16] El oscilador basado en transcripción-traducción, en otras palabras, TTO, es un modelo propuesto que postula que KaiC regula negativamente la transcripción KaiBC y KaiA regula positivamente la transcripción kaiBC. [16] Las proteínas Kai no regulan los genes regulados circadianos, pero sí regulan la expresión génica de todo el genoma en el modelo TTO de cianobacterias. [7] Un ejemplo de esto es el operón kaiBC. [7] Aún no está claro cómo el ciclo de retroalimentación de transcripción-traducción mantiene la periodicidad y cómo es flexible a los cambios ambientales. [7] Dado que estas proteínas son esenciales para que el organismo se adapte al medio ambiente, la comprensión de los genes es imperativa en la biología circadiana. [7] En cyanobacterium Synechococcus alargados (PCC 7942) kaiA, kaiB y kaiC son los componentes necesarios que componen el reloj circadiano. [7] El modelo TTO de cianobacterias es cuestionable debido al hallazgo de que la fosforilación de KaiC oscila independientemente de la transcripción / traducción del operón kaiBC. [7] Por lo tanto, se postuló que el marcapasos se basa en la fosforilación kaiC en lugar de un bucle de retroalimentación de transcripción / traducción. [7] KaiA aumenta la autofosforilación de kaiC. [7] KaiA y ATP promueven la fosforilación de T432. [16] KaiB mitiga el efecto de kaiA. [7] Por lo tanto, "la oscilación autónoma de la fosforilación de KaiC podría generarse mediante la cooperación entre kaiA y kaiB". [7]
Ver también
- Ritmos circadianos bacterianos
- Ritmo circadiano
- Cronobiología
- Cianobacterias
- KaiC
- Oscilación
- Fosforilación
- Synechococcus
Referencias
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