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La amplificación isotérmica mediada por bucle ( LAMP ) es una técnica de un solo tubo para la amplificación del ADN [1] [2] y una alternativa de bajo costo para detectar ciertas enfermedades. La amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) combina LAMP con un paso de transcripción inversa para permitir la detección de ARN.

LAMP es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica. A diferencia de la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que la reacción se lleva a cabo con una serie de pasos o ciclos de temperatura alternos, la amplificación isotérmica se lleva a cabo a una temperatura constante y no requiere un termociclador .

Técnica [ editar ]

En LAMP, la secuencia objetivo se amplifica a una temperatura constante de 60 a 65 ° C utilizando dos o tres conjuntos de cebadores y una polimerasa con alta actividad de desplazamiento de hebra, además de una actividad de replicación. Normalmente, se utilizan 4 cebadores diferentes para amplificar 6 regiones distintas en el gen diana, lo que aumenta la especificidad. Un par adicional de "cebadores de bucle" puede acelerar aún más la reacción. [3] La cantidad de ADN producido en LAMP es considerablemente más alta que la amplificación basada en PCR .

Esquema de un LAMP de biomarcadores de ácidos nucleicos de muestras de aguas residuales sin tratar, para cuantificar rápidamente el ADN mitocondrial (ADNmt) específico de humanos. [4]

El producto de amplificación puede detectarse mediante fotometría, midiendo la turbidez causada por el precipitado de pirofosfato de magnesio en solución como subproducto de la amplificación. [5] Esto permite una fácil visualización a simple vista o mediante enfoques de detección fotométrica simples para volúmenes pequeños. La reacción se puede seguir en tiempo real midiendo la turbidez [6] o mediante fluorescencia utilizando tintes intercalados como SYTO 9. [7] Tintes, como SYBR green, se puede utilizar para crear un cambio de color visible que se puede ver a simple vista sin la necesidad de equipos costosos, o para una respuesta que se puede medir con mayor precisión mediante instrumentación. Las moléculas de colorante intercalan o marcan directamente el ADN y, a su vez, pueden correlacionarse con el número de copias inicialmente presentes. Por tanto, LAMP también puede ser cuantitativo.

La detección en el tubo de la amplificación del ADN LAMP es posible utilizando calceína cargada con manganeso que comienza a emitir fluorescencia tras la complejación del manganeso por el pirofosfato durante la síntesis de ADN in vitro. [8]

Otro método para la detección visual de los amplicones LAMP a simple vista se basó en su capacidad para hibridar con ADN ss complementario unido a oro y así prevenir el cambio normal de color rojo a azul púrpura que de otro modo ocurriría durante la agregación inducida por sal de las partículas de oro. Por lo tanto, un método LAMP combinado con la detección de amplicones por AuNP puede tener ventajas sobre otros métodos en términos de tiempo de ensayo reducido, confirmación de amplicones por hibridación y uso de equipo más simple (es decir, sin necesidad de un termociclador, equipo de electroforesis o un transiluminador UV ). [9] [10]

Usos y beneficios [ editar ]

LAMP es una técnica de amplificación de ADN relativamente nueva, que debido a su simplicidad, robustez y bajo costo podría proporcionar importantes ventajas. LAMP tiene el potencial de ser utilizado como un ensayo de detección simple en el campo o en el punto de atención por parte de los médicos. [11] Dado que LAMP es isotérmico, lo que elimina la necesidad de costosos termocicladores utilizados en la PCR convencional, puede ser un método particularmente útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en países de ingresos bajos y medianos. [12] LAMP se está estudiando ampliamente para detectar enfermedades infecciosas como la tuberculosis, [13] la malaria, [14] [15] [16] la enfermedad del sueño [17] y el SARS-CoV-2 . [18] [19]En las regiones en desarrollo, aún no se ha validado ampliamente para otros patógenos comunes. [11]

Se ha observado que LAMP es menos sensible (más resistente) que la PCR a los inhibidores en muestras complejas como la sangre, probablemente debido al uso de una ADN polimerasa diferente (típicamente Bst - Bacillus stearothermophilus - ADN polimerasa en lugar de Taq polimerasa como en la PCR). Varios informes describen la detección exitosa de patógenos a partir de muestras mínimamente procesadas, como sangre tratada con calor, [20] [21] o en presencia de matrices de muestras clínicas. [22] Esta característica de LAMP puede ser útil en entornos de campo o de bajos recursos donde una extracción convencional de ADN o ARN antes de las pruebas de diagnóstico puede no ser práctica.

Limitaciones [ editar ]

LAMP es menos versátil que la PCR, la técnica de amplificación de ácidos nucleicos mejor establecida. LAMP es útil principalmente como técnica de diagnóstico o detección, pero no es útil para la clonación o muchas otras aplicaciones de biología molecular habilitadas por la PCR. Debido a que LAMP usa 4 (o 6) cebadores dirigidos a 6 (u 8) regiones dentro de un segmento bastante pequeño del genoma, y ​​debido a que el diseño de cebadores está sujeto a numerosas restricciones, es difícil diseñar conjuntos de cebadores para LAMP "a simple vista". Los paquetes de software comerciales , de código abierto [23] o gratuitos se utilizan generalmente para ayudar con el diseño del cebador LAMP, aunque las limitaciones del diseño del cebador significan que hay menos libertad para elegir el sitio objetivo que con la PCR.

En una aplicación de diagnóstico, esto debe equilibrarse con la necesidad de elegir un objetivo apropiado (por ejemplo, un sitio conservado en un genoma viral muy variable o un objetivo que es específico para una cepa particular de patógeno). Pueden ser necesarias múltiples secuencias degeneradas para cubrir las diferentes cepas variantes de la misma especie. Una consecuencia de tener tal cóctel de cebadores puede ser una amplificación no específica en la amplificación tardía.

Los enfoques de multiplexación para LAMP están menos desarrollados que para PCR. El mayor número de cebadores por objetivo en LAMP aumenta la probabilidad de interacciones cebador-cebador para conjuntos de objetivos multiplexados. El producto de LAMP es una serie de concatémeros de la región objetivo, dando lugar a un patrón característico de "escalera" o de bandas en un gel, en lugar de una sola banda como con la PCR. Aunque esto no es un problema cuando se detectan dianas individuales con LAMP, las aplicaciones de PCR multiplex "tradicionales" (de punto final) en las que la identidad de una diana se confirma por el tamaño de una banda en un gel no son factibles con LAMP. La multiplexación en LAMP se ha logrado eligiendo una región objetivo con un sitio de restricción y digiriendo antes de ejecutar en un gel, de modo que cada producto da lugar a un tamaño de fragmento distinto, [24] aunque este enfoque agrega complejidad al diseño experimental y al protocolo.

El uso de una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena en LAMP también excluye el uso de sondas de hidrólisis, por ejemplo , sondas TaqMan , que se basan en la actividad exonucleasa 5'-3 ' de la polimerasa Taq . Se ha informado de un enfoque alternativo de multiplexación en tiempo real basado en extintores de fluorescencia. [25]

Se puede agregar tinte verde SYBR para ver LAMP en tiempo real. Sin embargo, en la amplificación tardía, la amplificación del dímero de cebador puede contribuir a una señal falsa positiva. A diferencia de los ensayos de PCR tradicionales basados ​​en SYBR-green, no se puede realizar un análisis de la curva de fusión en LAMP para verificar la presencia de dímeros de cebadores . [ cita requerida ]

Ver también [ editar ]

  • Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa

Referencias [ editar ]

  1. ^ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000). "Amplificación isotérmica mediada por bucle de ADN" . Ácidos nucleicos Res . 28 (12): 63e – 63. doi : 10.1093 / nar / 28.12.e63 . PMC  102748 . PMID  10871386 .
  2. ^ Patente estadounidense 6410278 , Notomi T, Hase T, "Proceso para sintetizar ácido nucleico", publicada el 25 de junio de 2002, asignada a Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha 
  3. ^ Nagamine K, Hase T, Notomi T (2002). "Reacción acelerada por amplificación isotérmica mediada por bucle utilizando cebadores de bucle". Mol. Celda. Sondas . 16 (3): 223–9. doi : 10.1006 / mcpr.2002.0415 . PMID 12144774 . 
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  6. ^ Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T (2004). "Turbidimetría en tiempo real de la reacción LAMP para cuantificar la plantilla de ADN". J. Biochem. Biophys. Métodos . 59 (2): 145–57. doi : 10.1016 / j.jbbm.2003.12.005 . PMID 15163526 . 
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