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El análisis de la curva de fusión es una evaluación de las características de disociación del ADN bicatenario durante el calentamiento. A medida que aumenta la temperatura, la doble hebra comienza a disociarse, lo que conduce a un aumento de la intensidad de absorbancia, hipercromía . La temperatura a la que se desnaturaliza el 50% del ADN se conoce como temperatura de fusión .

La información recopilada se puede utilizar para inferir la presencia e identidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Esto se debe a que el emparejamiento de bases de GC tiene 3 enlaces de hidrógeno entre ellos, mientras que los pares de bases de AT tienen solo 2. ADN con un contenido de GC más alto, ya sea por su origen (contenido de GC: E. coli 0.50, M. luteus 0.72, poly d (AT ) 0.00) o, como se mencionó anteriormente, debido a los SNP, tendrá una temperatura de fusión más alta que el ADN con un contenido de AT más alto.

La información también proporciona pistas vitales sobre el modo de interacción de una molécula con el ADN. Las moléculas, como los intercaladores, se insertan entre pares de bases e interactúan a través del apilamiento pi . Esto tiene un efecto estabilizador sobre la estructura del ADN que conduce a un aumento en su temperatura de fusión. Asimismo, el aumento de las concentraciones de sal ayuda a difundir las repulsiones negativas entre los fosfatos en la columna vertebral del ADN. Esto también conduce a un aumento en la temperatura de fusión del ADN. Por el contrario, el pH puede tener un efecto negativo sobre la estabilidad del ADN, lo que puede provocar una disminución de su temperatura de fusión.

Implementación [ editar ]

Gráficos para mostrar la relación entre la fluorescencia y la temperatura para la sonda marcada diseñada para una secuencia de Wt, situaciones de Wt homocigotas, heterocigotas y mutantes homocigotas

La energía requerida para romper el enlace de hidrógeno base-base entre dos hebras de ADN depende de su longitud, contenido de GC y su complementariedad. Al calentar una mezcla de reacción que contiene secuencias de ADN de doble hebra y medir la disociación frente a la temperatura, se pueden inferir estos atributos.

Originalmente, la disociación de la hebra se observó utilizando medidas de absorbancia UV, [1] pero las técnicas basadas en medidas de fluorescencia [2] son ahora el enfoque más común.

La disociación dependiente de la temperatura entre dos cadenas de ADN se puede medir usando un fluoróforo intercalador de ADN , como sondas de ADN marcadas con SYBR green , EvaGreen o con fluoróforo . En el caso del verde SYBR (que presenta una fluorescencia 1000 veces más intensa mientras está intercalado en el surco menor de dos hebras de ADN), la disociación del ADN durante el calentamiento se puede medir por la gran reducción de la fluorescencia resultante. [3] Alternativamente, se pueden usar sondas yuxtapuestas (una con un fluoróforo y la otra con un extintor adecuado ) para determinar la complementariedad de la sonda con la secuencia diana. [3]

El gráfico de la primera derivada negativa de la curva de fusión puede facilitar la determinación de la temperatura de disociación (definida como 50% de disociación), en virtud de los picos así formados.

SYBR Green permitió la diferenciación del producto en el LightCycler en 1997. [4] También se demostró que las sondas de hibridación (o sondas FRET) proporcionan curvas de fusión muy específicas del híbrido de sonda a amplicón monocatenario (ss). Idaho Technology y Roche han hecho mucho para popularizar este uso en el instrumento LightCycler.

Aplicaciones [ editar ]

Desde finales de la década de 1990, el análisis de productos a través de SYBR Green, otros tintes específicos de doble hebra o el análisis de curvas de fusión basado en sondas se ha vuelto casi omnipresente. La técnica basada en sondas es lo suficientemente sensible para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y puede distinguir entre homocigotos de tipo salvaje , heterocigotos y homocigotos mutantes.alelos en virtud de los patrones de disociación producidos. Sin sondas, la fusión del amplicón (fusión y análisis de todo el producto de la PCR) no tuvo éxito en general para encontrar variantes de una sola base a través de perfiles de fusión. Con instrumentos de mayor resolución y colorantes avanzados, ahora es posible el análisis de fusión de amplicones de variantes de una base con varios instrumentos disponibles comercialmente. Por ejemplo: Applied Biosystems 7500 Fast System y 7900HT Fast Real-Time PCR System, el LightScanner de Idaho Technology (el primer dispositivo de fusión de alta resolución basado en placas), los instrumentos Rotor-Gene de Qiagen y los instrumentos LightCycler 480 de Roche.

Existen muchas investigaciones y ejemplos clínicos [5] en la literatura que muestran el uso del análisis de la curva de fusión para obviar o complementar los esfuerzos de secuenciación y, por lo tanto, reducir los costos.

Si bien la mayoría de las máquinas de PCR cuantitativas tienen la opción de generar y analizar la curva de fusión, el nivel de análisis y soporte de software varía. La fusión de alta resolución (conocida como fusión de alta resolución o HRM) es el avance de esta tecnología general y ha comenzado a ofrecer una mayor sensibilidad para la detección de SNP dentro de un amplicón completo teñido con colorante. Es menos costoso y de diseño más simple desarrollar sistemas de curvas de fusión sin sonda. Sin embargo, para aplicaciones de genotipado, donde se deben procesar grandes volúmenes de muestras, el costo de desarrollo puede ser menos importante que el rendimiento total y la facilidad de interpretación, lo que favorece los métodos de genotipado basados ​​en sondas.

Ver también [ editar ]

Referencias [ editar ]

  1. ^ Ansevin, AT; Vizard, DL; Marrón, BW; McConathy, J. (1976), "Desnaturalización térmica de alta resolución del ADN. I. Consideraciones teóricas y prácticas para la resolución de subtransiciones térmicas", Biopolymers , 15 (1): 153–74, doi : 10.1002 / bip.1976.360150111 , PMID  1244898
  2. ^ Ririe, KM; Rasmussen, RP; Wittwer, CT (1997), "Diferenciación de productos mediante el análisis de las curvas de fusión del ADN durante la reacción en cadena de la polimerasa", Anal. Biochem. , 245 (2): 154–60, doi : 10.1006 / abio.1996.9916 , PMID 9056205 
  3. ↑ a b Hou, Shaw (2010). Biocatálisis e Ingeniería Biomolecular . John Wiley e hijos. págs. 314–317.
  4. ^ Ririe, 1997
  5. ^ Lay MJ, Wittwer CT. (1997) Genotipado de fluorescencia en tiempo real del factor V Leiden durante la PCR de ciclo rápido. Clin Chem. Diciembre de 1997; 43 (12): 2262-7
  6. ^ Wienken CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011), "Las curvas de fusión termoforética cuantifican la conformación y estabilidad del ARN y el ADN", Investigación de ácidos nucleicos , 39 (8): e52-e52, doi : 10.1093 / nar / gkr035 , PMC 3082908 , PMID 21297115 .  

Enlaces externos [ editar ]

  • Ririe, KM; Rasmussen, RP; Wittwer, CT (1997). "Diferenciación de productos mediante análisis de curvas de fusión del ADN durante la reacción en cadena de la polimerasa". Anal Biochem . 245 (2): 154–160. doi : 10.1006 / abio.1996.9916 . PMID  9056205 .
  • Lo, Patcick CH (21 de octubre de 2014). "Los momentos: análisis de la curva de fusión" . BioTechniques . Consultado el 21 de octubre de 2014 .