El análisis de fusión de alta resolución ( HRM ) es una técnica poderosa en biología molecular para la detección de mutaciones , polimorfismos y diferencias epigenéticas en muestras de ADN bicatenario . Fue descubierto y desarrollado por Idaho Technology y la Universidad de Utah. [1] Tiene ventajas sobre otras tecnologías de genotipado , a saber:
- Es rentable frente a otras tecnologías de genotipado , como la secuenciación y la tipificación TaqMan SNP. Esto lo hace ideal para proyectos de genotipado a gran escala.
- Es rápido y potente, por lo que puede genotipar con precisión muchas muestras rápidamente.
- Es simple. Con un ensayo de HRM de buena calidad, los no genetistas pueden realizar un genotipado poderoso en cualquier laboratorio con acceso a una máquina de PCR en tiempo real capaz de HRM.
Método
El análisis de HRM se realiza en muestras de ADN de doble hebra. Normalmente, el usuario utilizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes del análisis de HRM para amplificar la región de ADN en la que se encuentra su mutación de interés. En el tubo de muestra ahora hay muchas copias de la región de ADN de interés. Esta región que se amplifica se conoce como amplicón. Después del proceso de PCR, comienza el análisis de HRM. El proceso es simplemente un calentamiento preciso del ADN del amplicón desde alrededor de 50 ˚C hasta alrededor de 95 ˚C. En algún momento durante este proceso, se alcanza la temperatura de fusión del amplicón y las dos hebras de ADN se separan o se "funden".
La clave de HRM es monitorear esta separación de hilos en tiempo real. Esto se logra mediante el uso de un tinte fluorescente. Los tintes que se utilizan para HRM se conocen como tintes intercalantes y tienen una propiedad única. Se unen específicamente al ADN de doble hebra y cuando se unen emiten una fluorescencia intensa. En ausencia de ADN bicatenario, no tienen nada a lo que unirse y solo emiten fluorescencia a un nivel bajo. Al comienzo del análisis de HRM, hay un alto nivel de fluorescencia en la muestra debido a los miles de millones de copias del amplicón. Pero a medida que la muestra se calienta y las dos hebras del ADN se funden, la presencia de ADN de doble hebra disminuye y, por lo tanto, se reduce la fluorescencia. La máquina HRM tiene una cámara que observa este proceso midiendo la fluorescencia. Luego, la máquina simplemente traza estos datos como un gráfico conocido como curva de fusión, que muestra el nivel de fluorescencia frente a la temperatura:
Comparación de curvas de fusión
La temperatura de fusión del amplicón a la que se separan las dos cadenas de ADN es completamente predecible. Depende de la secuencia de las bases del ADN. Si está comparando dos muestras de dos personas diferentes, deberían dar exactamente la misma curva de fusión en forma. Sin embargo, si una persona tiene una mutación en la región de ADN que ha amplificado, esto alterará la temperatura a la que las hebras de ADN se derriten. Entonces ahora las dos curvas de fusión parecen diferentes. La diferencia puede ser solo pequeña, quizás una fracción de grado, pero debido a que la máquina HRM tiene la capacidad de monitorear este proceso en "alta resolución", es posible documentar con precisión estos cambios y por lo tanto identificar si una mutación está presente o no. .
¿Tipo salvaje, heterocigoto u homocigoto?
Las cosas se vuelven un poco más complicadas que esto porque los organismos contienen dos ( o más ) copias de cada gen, conocidas como los dos alelos . Por lo tanto, si se toma una muestra de un paciente y se amplifica mediante PCR, se amplifican ambas copias de la región de ADN (alelos) de interés. Entonces, si buscamos una mutación, ahora hay tres posibilidades:
- Ninguno de los alelos contiene una mutación
- Uno u otro alelo contiene una mutación.
- Ambos alelos contienen una mutación.
Estos tres escenarios se conocen como "tipo salvaje", "heterocigoto" o "homocigoto", respectivamente. Cada uno da una curva de fusión que es ligeramente diferente. Con un ensayo de HRM de alta calidad, es posible distinguir entre estos tres escenarios.
Las variantes alélicas homocigotas se pueden caracterizar por un cambio de temperatura en la curva de fusión resultante producida por el análisis HRM. En comparación, los heterocigotos se caracterizan por cambios en la forma de la curva de fusión. Esto se debe al desajuste de pares de bases generado como resultado del apareamiento de heterodúplex desestabilizado entre las cadenas de tipo salvaje y variantes. Estas diferencias se pueden ver fácilmente en la curva de fusión resultante y las diferencias del perfil de fusión entre los diferentes genotipos se pueden amplificar visualmente generando una curva de diferencia [2]
Aplicaciones
Tipificación de SNP / detección de mutaciones puntuales
Los métodos de tipificación de SNP convencionales suelen consumir mucho tiempo y son costosos, y requieren la multiplexación de varios ensayos basados en sondas o el uso de microarrays de ADN. HRM es más rentable y reduce la necesidad de diseñar varios pares de cebadores y la necesidad de comprar sondas caras. El método HRM se ha utilizado con éxito para detectar una sola sustitución de G por A en el gen Vssc (canal de sodio sensible al voltaje) que confiere resistencia al acaricida permetrina en el ácaro de la sarna. Esta mutación da como resultado un cambio de codificación en la proteína (G1535D). El análisis de los ácaros de la sarna recolectados por HRM de poblaciones sospechosas de ser susceptibles y tolerantes a la permetrina mostró distintos perfiles de fusión. Se observó que los amplicones de los ácaros sensibles tenían una temperatura de fusión más alta en relación con los ácaros tolerantes, como se esperaba de la mayor termoestabilidad del par de bases GC [3]
En un campo más relevante para el diagnóstico clínico, se ha demostrado que la HRM es adecuada en principio para la detección de mutaciones en los genes de susceptibilidad al cáncer de mama BRCA1 y BRCA2. Se han identificado más de 400 mutaciones en estos genes.
La secuenciación de genes es el estándar de oro para identificar mutaciones. La secuenciación requiere mucho tiempo y trabajo y, a menudo, está precedida por técnicas utilizadas para identificar el ADN heterodúplex, que luego amplifica aún más estos problemas. HRM ofrece un método de tubo cerrado más rápido y conveniente para evaluar la presencia de mutaciones y da un resultado que puede investigarse más a fondo si es de interés. En un estudio realizado por Scott et al. en 2006, [4] se utilizaron 3 líneas celulares que albergaban diferentes mutaciones de BRCA para evaluar la metodología HRM. Se encontró que los perfiles de fusión de los productos de PCR resultantes podrían usarse para distinguir la presencia o ausencia de una mutación en el amplicón. De manera similar, en 2007 Krypuy et al. [5] mostró que el diseño cuidadoso de los ensayos HRM (con respecto a la colocación del cebador) podría emplearse con éxito para detectar mutaciones en el gen TP53, que codifica la proteína supresora de tumores p53 en muestras clínicas de cáncer de mama y ovario. Ambos estudios destacaron el hecho de que los cambios en el perfil de fusión pueden tener la forma de un cambio en la temperatura de fusión o una diferencia obvia en la forma de la curva de fusión. Ambos parámetros son función de la secuencia del amplicón. El consenso es que la HRM es un método rentable que puede emplearse como una pantalla inicial para muestras sospechosas de albergar polimorfismos o mutaciones. Esto reduciría el número de muestras que deben investigarse más utilizando métodos más convencionales.
Prueba de zigosidad
Actualmente, se utilizan muchos métodos para determinar el estado de cigosidad de un gen en un locus particular. Estos métodos incluyen el uso de PCR con sondas diseñadas específicamente para detectar las variantes de los genes (la tipificación de SNP es el caso más simple). En los casos en que estén implicados tramos de variación más largos, puede ser necesario un análisis de los amplicones después de la PCR. Se pueden medir los cambios en los perfiles de restricción enzimática, electroforéticos y cromatográficos. Estos métodos suelen consumir más tiempo y aumentan el riesgo de contaminación por amplicones en el laboratorio, debido a la necesidad de trabajar con altas concentraciones de amplicones en el laboratorio después de la PCR. El uso de HRM reduce el tiempo requerido para el análisis y el riesgo de contaminación. HRM es una solución más rentable y el elemento de alta resolución no solo permite la determinación de homo y heterocigosidad , sino que también resuelve información sobre el tipo de homo y heterocigosidad, con diferentes variantes de genes que dan lugar a diferentes formas de curvas de fusión. Un estudio de Gundry et al. 2003, [6] mostraron que el marcaje fluorescente de un cebador (en el par) ha demostrado ser favorable sobre el uso de un colorante intercalante tal como I verde SYBR . Sin embargo, se ha avanzado en el desarrollo y uso de colorantes intercalantes mejorados [7] que reducen el problema de la inhibición de la PCR y las preocupaciones sobre la intercalación no saturante del colorante.
Epigenética
La metodología HRM también se ha aprovechado para proporcionar un análisis confiable del estado de metilación del ADN. Esto es importante ya que los cambios en el estado de metilación de los genes supresores de tumores, genes que regulan la apoptosis y la reparación del ADN, son características de los cánceres y también tienen implicaciones para las respuestas a la quimioterapia. Por ejemplo, los pacientes con cáncer pueden ser más sensibles al tratamiento con agentes alquilantes del ADN si el promotor del gen de reparación del ADN MGMT del paciente está metilado. En un estudio que probó el estado de metilación del promotor MGMT en 19 muestras colorrectales, se encontró que 8 muestras estaban metiladas. [8] Otro estudio comparó el poder predictivo de la metilación del promotor MGMT en 83 pacientes con glioma de alto grado obtenido por MSP , pirosecuenciación y HRM. Se encontró que el método HRM era al menos equivalente a la pirosecuenciación en la cuantificación del nivel de metilación. [9]
El ADN metilado se puede tratar mediante modificación con bisulfito, que convierte las citosinas no metiladas en uracilo . Por lo tanto, los productos de PCR resultantes de un molde que originalmente no estaba metilado tendrán un punto de fusión más bajo que los derivados de un molde metilado. HRM también ofrece la posibilidad de determinar la proporción de metilación en una muestra dada, comparándola con una curva estándar que se genera mezclando diferentes proporciones de ADN metilado y no metilado. Esto puede ofrecer información sobre el grado de metilación que puede tener un tumor y así dar una indicación del carácter del tumor y en qué medida se desvía de lo que es "normal".
El HRM también es prácticamente ventajoso para su uso en diagnóstico, debido a su capacidad de adaptarse a pruebas de detección de alto rendimiento y, nuevamente, minimiza la posibilidad de propagación y contaminación del amplicón dentro de un laboratorio, debido a su formato de tubo cerrado.
Tintes intercalados
Para seguir la transición de dsDNA (bicatenario) a ssDNA (monocatenario), se emplean colorantes intercalados. Estos colorantes muestran una emisión de fluorescencia diferencial que depende de su asociación con el ADN monocatenario o bicatenario. SYBR Green I es un tinte de primera generación para HRM. Emite fluorescencia cuando se intercala en dsDNA y no en ssDNA. Debido a que puede inhibir la PCR a altas concentraciones, se usa en concentraciones de subsaturación. Recientemente, algunos investigadores han desaconsejado el uso de SYBR Green I para HRM, [10] alegando que se requieren modificaciones sustanciales del protocolo. Esto se debe a que se sugiere que la falta de precisión puede resultar del "salto de tinte", donde el tinte de un dúplex fundido puede reincorporarse en regiones de dsDNA que aún no se habían fundido. [6] [10] Nuevos tintes saturantes como LC Green y LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy y SYTO 9 están disponibles en el mercado y se han utilizado con éxito para HRM. Sin embargo, algunos grupos han utilizado con éxito SYBR Green I para HRM con los instrumentos Corbett Rotorgene [11] y abogan por el uso de SYBR Green I para aplicaciones de HRM.
Diseño de experimentos de fusión de alta resolución
Los ensayos de fusión de alta resolución normalmente implican la amplificación de qPCR seguida de una curva de fusión recogida con un tinte fluorescente. Debido a la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución, es necesario considerar cuidadosamente las condiciones de ciclo de la PCR, la calidad del ADN de la plantilla y los parámetros de la curva de fusión. [12] Para obtener resultados precisos y repetibles, las condiciones del ciclo térmico de la PCR deben optimizarse para garantizar que la región de ADN deseada se amplifique con alta especificidad y un sesgo mínimo entre las variantes de secuencia. La curva de fusión se realiza típicamente en un amplio rango de temperaturas en pequeños incrementos (~ 0.3 ° C) que son lo suficientemente largos (~ 10 segundos) para que el ADN alcance el equilibrio en cada paso de temperatura.
Además de típicos de cebadores consideraciones de diseño, el diseño de cebadores para ensayos de fusión de alta resolución implica la maximización de las diferencias termodinámicas entre los productos de PCR que pertenecen a diferentes genotipos. Los amplicones más pequeños generalmente producen una mayor variación de temperatura de fusión que los amplicones más largos, pero la variabilidad no se puede predecir a simple vista. Por esta razón, es fundamental predecir con precisión la curva de fusión de los productos de la PCR al diseñar cebadores que distingan las variantes de secuencia. Se dispone de software especializado, como uMelt [13] y DesignSignatures , [14] para ayudar a diseñar cebadores que maximicen la variabilidad de la curva de fusión específicamente para ensayos de fusión de alta resolución.
Ver también
- Diseñador de balizas
- Análisis de la curva de fusión
Referencias
- ^ Para un tratamiento académico de la historia de la gestión de recursos humanos, consulte http://www.dna.utah.edu/Hi-Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html
- ^ S Taylor et al., 2010. Una guía práctica para el genotipado del análisis de fusión de alta resolución. Nota técnica de BioRad 6004.
- ^ Pasay C, Arlian L, Morgan M, et al. (Marzo de 2008). "Análisis de fusión de alta resolución para la detección de una mutación asociada con la resistencia a la permetrina en una población de ácaros de la sarna". Medicina. Veterinario. Entomol . 22 (1): 82–8. doi : 10.1111 / j.1365-2915.2008.00716.x . PMID 18380658 .
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enlaces externos
- Tecnología HRM