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Principio de la tecnología MST: MST se realiza en capilares delgados en solución libre, lo que proporciona condiciones cercanas a las nativas (libre de inmovilización en cualquier tampón, incluso en biolíquidos complejos) y un instrumento libre de mantenimiento. Al realizar un experimento MST, un láser infrarrojo induce un gradiente de temperatura microscópico y se detecta TRIC y termoforesis. TRIC depende del microambiente del fluoróforo, que normalmente cambia en los eventos de unión. La termoforesis, el movimiento de la molécula en el gradiente de temperatura, depende de tres parámetros que normalmente cambian con la interacción. Por tanto, la señal de MST global se representa frente a la concentración de ligando para obtener una curva de respuesta a la dosis, a partir de la cual se puede deducir la afinidad de unión.

La termoforesis a microescala ( MST ) es una tecnología para el análisis biofísico de interacciones entre biomoléculas . La termoforesis a microescala se basa en la detección de un cambio de fluorescencia de un objetivo inducido por la temperatura en función de la concentración de un ligando no fluorescente. El cambio observado en la fluorescencia se basa en dos efectos distintos. Por un lado, se basa en un cambio de intensidad relacionado con la temperatura (TRIC) de la sonda fluorescente, que puede verse afectado por eventos de unión. Por otro lado, se basa en la termoforesis , el movimiento dirigido de partículas en un gradiente de temperatura microscópico .. Cualquier cambio del microambiente químico de la sonda fluorescente, así como los cambios en la capa de hidratación de las biomoléculas, dan como resultado un cambio relativo de la fluorescencia detectada cuando se aplica un gradiente de temperatura y pueden usarse para determinar las afinidades de unión . MST permite medir interacciones directamente en solución sin necesidad de inmovilización en una superficie (tecnología sin inmovilización).

Aplicaciones [ editar ]

Afinidad [ editar ]

Estequiometría

Parámetros termodinámicos [ editar ]

La MST se ha utilizado para estimar las contribuciones entálpicas y entrópicas a las interacciones biomoleculares. [10]

Información adicional [ editar ]

  • Propiedad de la muestra (homogeneidad, agregación, estabilidad)
  • Múltiples sitios de unión, cooperatividad

Tecnología [ editar ]

MST se basa en la detección cuantificable de un cambio de fluorescencia en una muestra cuando se aplica un cambio de temperatura. La fluorescencia de una molécula diana puede ser extrínseca o intrínseca ( aminoácidos aromáticos ) y se ve alterada en los gradientes de temperatura debido a dos efectos distintos. Por un lado, el cambio de intensidad relacionado con la temperatura (TRIC), que describe la propiedad intrínseca de los fluoróforos para cambiar su intensidad de fluorescencia en función de la temperatura. El alcance del cambio en la intensidad de la fluorescencia se ve afectado por el entorno químico de la sonda fluorescente, que puede alterarse en eventos de unión debido a cambios conformacionales o proximidad de ligandos . [11] [12]Por otro lado, la MST también se basa en el movimiento dirigido de moléculas a lo largo de gradientes de temperatura, un efecto denominado termoforesis. Una diferencia de temperatura espacial ΔT conduce a un cambio en la concentración de moléculas en la región de temperatura elevada, cuantificado por el coeficiente de Soret S T : c caliente / c frío = exp (-S T ΔT). [13] [14]Tanto el TRIC como la termoforesis contribuyen a la señal registrada en las mediciones de MST de la siguiente manera: ∂ / ∂T (cF) = c∂F / ∂T + F∂c / ∂T. El primer término de esta ecuación c∂F / ∂T describe TRIC como un cambio en la intensidad de fluorescencia (F) en función de la temperatura (T), mientras que el segundo término F∂c / ∂T describe la termoforesis como el cambio en la concentración de partículas. (c) en función de la temperatura. La termoforesis depende de la interfaz entre la molécula y el disolvente. En condiciones de tampón constantes, la termoforesis mide el tamaño, la carga y la entropía de solvatación de las moléculas. La termoforesis de una molécula A marcada con fluorescencia típicamente difiere significativamente de la termoforesis de un complejo AT molécula-objetivo debido a diferencias de tamaño, carga y entropía de solvatación. Esta diferencia en la molécula 'La termoforesis se utiliza para cuantificar la unión en experimentos de titulación en condiciones de tampón constantes.

El movimiento termoforético de la molécula marcada con fluorescencia se mide controlando la distribución de fluorescencia F dentro de un capilar. El gradiente de temperatura microscópico es generado por un láser IR, que se enfoca en el capilar y es fuertemente absorbido por el agua. La temperatura de la solución acuosa en el punto del láser se eleva en ΔT = 1-10 K. Antes de encender el láser IR, se observa una distribución de fluorescencia homogénea F frío dentro del capilar. Cuando se enciende el láser de infrarrojos, se producen dos efectos en la misma escala de tiempo, lo que contribuye a la nueva distribución de fluorescencia F caliente. La relajación térmica induce una caída dependiente de la unión en la fluorescencia del tinte debido a su respuesta local dependiente del medio ambiente al salto de temperatura (TRIC). Al mismo tiempo, las moléculas se mueven típicamente de la región calentada localmente a las regiones frías externas. La concentración local de moléculas disminuye en la región calentada hasta que alcanza una distribución de estado estable.

Mientras que la difusión de masa D dicta la cinética de agotamiento, S T determina la relación de concentración en estado estable c caliente / c frío = exp (-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT bajo un aumento de temperatura ΔT. La norma F de fluorescencia normalizada = F caliente / F frío mide principalmente esta relación de concentración, además de TRIC ∂F / ∂T. En la aproximación lineal encontramos: F norma = 1 + (∂F / ∂TS T ) ΔT. Debido a la linealidad de la intensidad de la fluorescencia y el agotamiento termoforético, la fluorescencia normalizada de la molécula no unida F norma (A) y el complejo unido Fnorma (AT) superponer linealmente. Al denotar x la fracción de moléculas unidas a los objetivos, la señal de fluorescencia cambiante durante la titulación del objetivo T viene dada por: F norma = (1-x) F norma (A) + x F norma (AT). [11]

Los parámetros de unión cuantitativos se obtienen utilizando una dilución en serie del sustrato de unión. Al trazar la norma F frente al logaritmo de las diferentes concentraciones de la serie de diluciones, se obtiene una curva de unión sigmoidea. Esta curva de unión se puede ajustar directamente con la solución no lineal de la ley de acción de masas , con la constante de disociación K D como resultado. [15] [16] [17]

Referencias [ editar ]

  1. ^ Asmari M, Ratih R, Alhazmi HA, El Deeb S (febrero de 2018). "Termoforesis para caracterizar la interacción biomolecular" (PDF) . Métodos . 146 : 107-119. doi : 10.1016 / j.ymeth.2018.02.003 . PMID  29438829 .
  2. ↑ Mueller AM, Breitsprecher D, Duhr S, Baaske P, Schubert T, Längst G (2017). "Micro Escala termoforesis: Un rápido y preciso método para cuantificar proteína-ácido nucleico Interacciones en la Solución". Termoforesis MicroScale: Un método rápido y preciso para cuantificar las interacciones proteína-ácido nucleico en solución . Métodos en Biología Molecular. 1654 . págs. 151-164. doi : 10.1007 / 978-1-4939-7231-9_10 . ISBN 978-1-4939-7230-2. PMID  28986788 .
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  5. ^ Seidel SA, Wienken CJ, Geissler S, Jerabek-Willemsen M, Duhr S, Reiter A, Trauner D, Braun D, ​​Baaske P (2012). "La termoforesis a microescala sin etiqueta discrimina los sitios y la afinidad de la unión proteína-ligando" . Angew. Chem. En t. Ed. Engl . 51 (42): 10656–9. doi : 10.1002 / anie.201204268 . PMC 3588113 . PMID 23001866 .  
  6. ^ Linke P, Amaning K, Maschberger M, Vallee F, Steier V, Baaske P, Duhr S, Breitsprecher D, Rak A (abril de 2016). "Un enfoque de cribado de termoforesis a microescala automatizado para el descubrimiento de plomo basado en fragmentos" . Revista de cribado biomolecular . 21 (4): 414-21. doi : 10.1177/1087057115618347 . PMC 4800460 . PMID 26637553 .  
  7. ^ Jerabek-Willemsen M, Wienken CJ, Braun D, ​​Baaske P, Duhr S (agosto de 2011). "Estudios de interacción molecular mediante termoforesis a microescala" . Tecnologías de análisis y desarrollo de fármacos . 9 (4): 342–53. doi : 10.1089 / adt.2011.0380 . PMC 3148787 . PMID 21812660 .  
  8. ^ Dijkman PM, Watts A (noviembre de 2015). "Modulación de lípidos de los primeros eventos de señalización del receptor acoplado a proteína G" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranas . 1848 (11 Pt A): 2889–97. doi : 10.1016 / j.bbamem.2015.08.004 . PMID 26275588 . 
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  12. ^ Gupta AJ, Duhr S, Baaske P (2018). Termoforesis a microescala (MST) . Enciclopedia de biofísica . págs. 1-5. doi : 10.1007 / 978-3-642-35943-9_10063-1 . ISBN 9783642359439.
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  14. ^ Reineck P, Wienken CJ, Braun D (2010). "Termoforesis de ADN monocatenario". Electroforesis . 31 (2): 279–86. doi : 10.1002 / elps.200900505 . PMID 20084627 . S2CID 36614196 .  
  15. ^ Wienken CJ, Baaske P, Rothbauer U, Braun D, ​​Duhr S (2010). "Ensayos de unión a proteínas en líquidos biológicos mediante termoforesis a microescala" . Nat Commun . 1 (7): 100. Código Bibliográfico : 2010NatCo ... 1..100W . doi : 10.1038 / ncomms1093 . PMID 20981028 . 
  16. ^ Baaske P, Wienken C, Duhr S (2009). "Optisch erzeugte Thermophorese für die Bioanalytik" [Termoforesis generada ópticamente para bioanálisis] (PDF) . Biophotonik (en alemán): 22-24.[ enlace muerto ]
  17. ^ Wienken CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011). "Las curvas de fusión termoforética cuantifican la conformación y estabilidad del ARN y el ADN" . Ácidos nucleicos Res . 39 (8): e52. doi : 10.1093 / nar / gkr035 . PMC 3082908 . PMID 21297115 .