Las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real ( MIQE ) son un conjunto de protocolos para realizar y notificar experimentos y datos cuantitativos de PCR en tiempo real , según lo ideado por Bustin et al. en 2009. [1] Fueron ideados después de que se publicara un artículo en 2002 que afirmaba detectar el virus del sarampión en niños con autismo mediante el uso de RT-qPCR, pero los resultados demostraron ser completamente irreproducibles por otros científicos. [2] Los propios autores tampoco intentaron reproducirlos y se encontró que los datos sin procesar tenían una gran cantidad de errores y errores básicos en el análisis. Este incidente llevó a Stephen Bustinpara crear las pautas de MIQE para proporcionar un nivel de referencia de calidad para los datos de qPCR publicados en la literatura científica. [2]
Propósito
Las pautas de MIQE se crearon debido a la baja calidad de los datos de qPCR enviados a las revistas académicas en ese momento, lo que solo se estaba volviendo más común a medida que la maquinaria de secuenciación de próxima generación permitía ejecutar tales experimentos a un costo más económico. Debido a que la técnica se utiliza en toda la ciencia en múltiples campos, los instrumentos, métodos y diseños de cómo se usa qPCR difieren enormemente. Para ayudar a mejorar la calidad general, las pautas de MIQE se hicieron como sugerencias generalizadas sobre procedimientos experimentales básicos y formas de datos que deben recopilarse como un nivel mínimo de información reportada para que otros investigadores la comprendan y utilicen al leer el material publicado. La comunidad científica consideró importante establecer un conjunto de directrices reconocidas y ampliamente acordadas como estas, especialmente debido a la cantidad cada vez mayor de trabajo científico procedente de países en desarrollo con muchos idiomas y protocolos diferentes. [3]
Historia
Desarrollos de la versión original
En 2009, un grupo internacional de científicos encabezado por Stephen Bustin colaboró para elaborar un conjunto de directrices sobre cómo realizar la qPCR y qué formas de datos deberían recopilarse y publicarse en el proceso. Esto también permitió a los editores y revisores de revistas científicas emplear las pautas al revisar un artículo enviado que incluía datos de qPCR. Por lo tanto, las pautas se establecieron como una especie de lista de verificación para cada paso del procedimiento con ciertos elementos marcados como esenciales (E) al enviar datos para su publicación y otros marcados como simplemente deseables (D). [4]
En septiembre de 2010 se publicó una versión adicional de las directrices para su uso con PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. También actuó como un resumen para la forma más amplia de las directrices. [5] Otros investigadores han estado creando versiones adicionales para formas específicas de qPCR que pueden requerir un conjunto complementario o diferente de elementos para verificar, incluyendo qPCR de célula única [6] y PCR digital (dPCR). [7] También se ha revisado el cumplimiento adecuado de las directrices MIQE existentes en otras áreas científicas, incluida la fotobiomodulación [8] y los biomarcadores clínicos . [9]
Bustin señaló en 2014 (y nuevamente por él en 2017) que hubo cierta aceptación y uso de las pautas de MIQE dentro de la comunidad científica, pero todavía había demasiados artículos publicados con experimentos de qPCR que carecían incluso de los más básica de presentación de datos y adecuada confirmación de la efectividad de dichos datos. Estos estudios mantuvieron importantes problemas de reproducibilidad, donde las conclusiones de su evidencia no pudieron ser replicadas por otros investigadores, lo que puso en duda los resultados iniciales. Todo esto fue a pesar de que muchos artículos citaron directamente la publicación MIQE original de Bustin, pero no siguieron la lista de verificación de la guía de material en sus propios experimentos. [2] [10] Sin embargo, algunos investigadores han señalado al menos cierto éxito, con una serie de artículos que las revistas académicas rechazaron para su publicación debido a que no aprobaron las listas de verificación de MIQE. Otros estudios se han retractado después del hecho una vez que se notó su falta de datos adecuados para aprobar las pautas de MIQE y se señaló públicamente a los editores de la revista. [11]
Ajuste de pautas
Al configurar sus nuevos sistemas qPCR comparativos titulados "Puntos en cajas" en 2017, New England Biolabs declaró que habían diseñado la parte de recopilación de datos en torno a las pautas de MIQE para que los datos se ajustaran a todas las listas de verificación de parámetros mínimos en los protocolos. [12] Otras compañías de instrumentos científicos han ayudado en el cumplimiento de las pautas adaptando intencionalmente sus dispositivos para ellos, incluida la creación de Bio-Rad de una aplicación móvil que permite el marcado activo de la lista de verificación MIQE a medida que se completa cada paso. [13]
En junio de 2020 se realizó una descripción general del décimo aniversario desde la publicación de las pautas de MIQE y se discutieron los estudios científicos que habían producido resultados mejores y más organizados al seguir las pautas. [14] En agosto de 2020, se publicó una versión actualizada de las directrices para el método de PCR digital para dar cuenta de las mejoras en maquinaria, tecnologías y técnicas desde la versión original de 2013. Se agregaron pasos de pautas adicionales para el análisis de datos, al tiempo que se proporciona una tabla de lista de verificación más simplificada para que la utilicen los investigadores. [15] Se desarrolló un ensayo de orientación RT-qPCR junto con Stephen Bustin utilizando las pautas MIQE para biomarcadores clínicos en diciembre de 2020 con el fin de identificar la presencia clínica de partículas virales COVID-19 durante la pandemia de COVID-19 . [dieciséis]
Descripción general de las pautas
Las pautas de MIQE se dividen en 9 secciones diferentes que componen la lista de verificación. Estos incluyen no solo consideraciones para realizar la qPCR en sí, sino también cómo se recopilan, analizan y presentan los datos resultantes. Una parte importante de este último es incluir información relacionada con el software de análisis utilizado y también enviar los datos sin procesar a las bases de datos relevantes. [1]
Diseño experimental
Gran parte de las pautas incluyen acciones básicas que normalmente se incluirían en experimentos y publicaciones independientemente, como un elemento para describir las diferencias del grupo experimental y de control. Otra información similar incluye cuántas unidades individuales se utilizan en cada grupo en el experimento. Estas dos piezas se definen como imprescindibles para cualquier estudio. Esta sección también incluye dos puntos deseables, que señalan si el propio laboratorio del autor o un laboratorio central de la universidad u organización realizó el ensayo de qPCR y un reconocimiento a cualquier otra persona que contribuyó al trabajo. [1]
Muestra
Los requisitos esenciales que deben cumplir las muestras y el material de muestra incluyen una descripción de la muestra, qué forma de disección se usó, qué método de procesamiento se realizó, si las muestras se congelaron o fijaron y cuánto tiempo tomó, y qué condiciones de muestra se usaron. . También es deseable conocer el volumen o la masa de la muestra que se procesó para la qPCR. [1]
Extracción de ácidos nucleicos
Para el proceso de extracción de ADN / ARN, hay una serie de pautas esenciales. Esto incluye una descripción del proceso de extracción realizado, una declaración sobre qué kit de extracción de ADN se usó y cualquier cambio realizado en las instrucciones, detalles sobre si se usó algún tratamiento con ADNasa o RNasa , una declaración sobre si se evaluó alguna contaminación, una cuantificación de la cantidad de material genético extraído, una descripción de los instrumentos utilizados para la extracción, los métodos utilizados para retener la integridad del ARN, una declaración sobre el número de integridad del ARN y el indicador de calidad y el ciclo de cuantificación (Cq) alcanzado y, por último, qué pruebas se realizaron para determinar la presencia o ausencia de inhibidores . Cuatro piezas de información deseadas son de dónde se obtuvieron los reactivos utilizados, qué nivel de pureza genética se obtuvo, qué rendimiento se obtuvo y una imagen de gel de electroforesis para su confirmación. [1]
Transcripción inversa
Las partes esenciales principales para esta fase incluyen detallar las condiciones de reacción en su totalidad, dar tanto la cantidad de ARN utilizado como el volumen total de la reacción, dar información sobre el oligonucleótido utilizado como cebador y su concentración, la concentración y el tipo de transcriptasa inversa. utilizado, y por último la temperatura y el tiempo transcurrido para la reacción. También es deseable tener los números de catálogo de los reactivos usados y sus fabricantes, la desviación estándar para la Cq con y sin la transcriptasa involucrada, y cómo se almacenó el ADNc . [1]
información de destino de qPCR
Toda la información básica con respecto al objetivo es necesaria aquí, incluido el símbolo del gen, el número de la base de datos de acceso para la secuencia en cuestión, la longitud de la secuencia que se amplifica, información sobre la pantalla de especificidad utilizada como BLAST , para qué variantes de empalme existen la secuencia y dónde está el exón o intrón de cada cebador. Hay varias piezas de información deseadas, pero no requeridas para esta sección, como la ubicación del amplicón , si existen pseudogenes u homólogos , si se realizó una alineación de secuencia y los datos obtenidos de ella, y cualquier dato sobre la estructura secundaria de la secuencia amplificada. [1]
oligonucleótidos qPCR
La creación de los oligonucleótidos requiere solo dos piezas de información esencial: las secuencias de cebadores utilizadas y la ubicación y los detalles de cualquier modificación realizada en la secuencia. Pero hay varios datos deseables, incluido el número de identificación de la base de datos RTPrimerDB, las secuencias de las sondas , el fabricante utilizado para hacer los oligos y cómo se purificaron. [1]
protocolo qPCR
Como uno de los segmentos principales de las pautas, hay varias partes esenciales en la lista de verificación para el proceso de qPCR en sí. Esto incluye el conjunto completo de condiciones utilizadas para la reacción, el volumen tanto de la reacción como del cDNA, las concentraciones de las sondas, iones de magnesio y dNTP , qué tipo de polimerasa se utilizó y su concentración, qué kit se utilizó y su fabricante, qué aditivos para la reacción se utilizaron, quién fabricó la máquina qPCR y qué parámetros se establecieron para el proceso de termociclado . Los únicos datos adicionales deseados son la composición química del tampón utilizado, quién fabricó las placas y los tubos utilizados y cuál es su número de catálogo, y si la reacción se preparó manualmente o mediante una máquina. [1] [17]
validación qPCR
Para confirmar la efectividad y calidad del proceso de qPCR que se realizó, son varias las acciones y datos posteriores que se deben presentar. Esto incluye explicar el método específico para verificar que el proceso funcionó, como usar un gel, secuenciar directamente el material genético, mostrar un perfil de fusión o de digestión por enzima de restricción . Si se utilizó SYBR Green I , se debe proporcionar la Cq del grupo de control sin ADN molde. Otros datos esenciales incluyen la calibración de las curvas de la máquina con la pendiente y la intersección y, la eficiencia del proceso de PCR determinada a partir de la pendiente mencionada anteriormente, los coeficientes de correlación (r cuadrado) para las curvas de calibración, el rango dinámico de las curvas lineales. , la Cq encontrada en la concentración más baja donde el 95% de los resultados todavía eran positivos ( LOD ) junto con la evidencia del LOD en sí, y por último, si se usa un múltiplex , entonces se debe dar la eficiencia y LOD para cada ensayo realizado. [1] [17]
La información adicional deseada incluye evidencia dada que la optimización de qPCR se produjo mediante el uso de gradientes, los intervalos de confianza para mostrar la eficiencia de la qPCR y los intervalos de confianza para todo el rango probado. [1]
Análisis de los datos
La sección final de las pautas incluye información sobre cómo se realizó el análisis de los datos de qPCR. Las partes esenciales de eso incluyen el programa y la versión del programa utilizada para el análisis, el método de cómo se determinó el Cq, averiguar los puntos atípicos en los datos y cómo se usan o excluyen y por qué, qué resultados se encontraron para los controles. sin material genético de plantilla, una explicación de por qué se eligieron los genes de referencia utilizados y por qué se eligió el número de ellos, el método utilizado para normalizar los datos, cuántas réplicas técnicas se incluyeron, qué tan repetibles eran los datos dentro de los ensayos, qué Se utilizaron métodos para determinar la importancia de los resultados y qué software se utilizó para esta parte del análisis cualitativo. [1]
También se desea incluir información sobre el número de réplicas biológicas y si coinciden con los resultados de las réplicas técnicas, los datos de reproducibilidad para las variantes de concentración, datos sobre el análisis de potencia y, por último, que los investigadores envíen los datos brutos en el Formato de archivo RDML. [1] [18]
Referencias
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Otras lecturas
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