La secuenciación de una sola célula examina la información de la secuencia de células individuales con tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) optimizadas , lo que proporciona una mayor resolución de las diferencias celulares y una mejor comprensión de la función de una célula individual en el contexto de su microambiente. [1] Por ejemplo, en el cáncer, la secuenciación del ADN de células individuales puede proporcionar información sobre mutaciones transportadas por pequeñas poblaciones de células. En desarrollo, la secuenciación de los ARN expresados por células individuales puede dar una idea de la existencia y el comportamiento de diferentes tipos de células. [2]En los sistemas microbianos, una población de la misma especie puede parecer genéticamente clonal, pero la secuenciación unicelular del ARN o las modificaciones epigenéticas pueden revelar una variabilidad de célula a célula que puede ayudar a las poblaciones a adaptarse rápidamente para sobrevivir en entornos cambiantes. [3]
Fondo
Una célula humana típica consta de aproximadamente 2 x 3,3 mil millones de pares de bases de ADN y 600 millones de bases de ARNm. Por lo general, se utiliza una mezcla de millones de células para secuenciar el ADN o el ARN mediante métodos tradicionales como la secuenciación de Sanger o la secuenciación de Illumina . Al utilizar la secuenciación profunda de ADN y ARN de una sola célula, las funciones celulares se pueden investigar ampliamente. [1] Como los experimentos típicos de NGS, los protocolos de secuenciación de una sola célula generalmente contienen los siguientes pasos: aislamiento de una sola célula, extracción y amplificación de ácido nucleico, preparación de la biblioteca de secuenciación, secuenciación y análisis de datos bioinformáticos . Es más difícil realizar la secuenciación de células individuales en comparación con la secuenciación de células a granel. La cantidad mínima de materiales de partida de una sola celda hace que la degradación, la pérdida de muestras y la contaminación ejerzan efectos pronunciados sobre la calidad de los datos de secuenciación. Además, debido al nivel de picogramos de la cantidad de ácidos nucleicos utilizados, [4] a menudo se necesita una gran amplificación durante la preparación de la muestra de secuenciación de una sola célula, lo que resulta en una cobertura desigual, ruido y cuantificación inexacta de los datos de secuenciación.
Las recientes mejoras técnicas hacen de la secuenciación de células individuales una herramienta prometedora para abordar un conjunto de problemas aparentemente inaccesibles. Por ejemplo, las muestras heterogéneas, los tipos de células raras, las relaciones de linaje celular, el mosaicismo de los tejidos somáticos, los análisis de microbios que no pueden cultivarse y la evolución de la enfermedad se pueden dilucidar mediante la secuenciación de una sola célula. [5] La secuenciación unicelular fue seleccionada como el método del año 2013 por Nature Publishing Group. [6]
Secuenciación del genoma unicelular (ADN)
La secuenciación del genoma de ADN de una sola célula implica aislar una sola célula, amplificar el genoma completo o la región de interés, construir bibliotecas de secuenciación y luego aplicar la secuenciación de ADN de próxima generación (por ejemplo , Illumina , Ion Torrent , MGI ). En los sistemas de mamíferos, la secuenciación de ADN unicelular se ha aplicado ampliamente para estudiar la fisiología y la enfermedad normales. La resolución unicelular puede descubrir las funciones del mosaicismo genético o la heterogeneidad genética intratumoral en el desarrollo del cáncer o la respuesta al tratamiento. [7] En el contexto de los microbiomas, un genoma de un solo organismo unicelular se denomina genoma único amplificado (SAG). Los avances en la secuenciación de ADN unicelular han permitido la recopilación de datos genómicos de especies procariotas no cultivadas presentes en microbiomas complejos. [8] Aunque los SAG se caracterizan por una baja integridad y un sesgo significativo, los avances informáticos recientes han logrado el ensamblaje de genomas casi completos a partir de SAG compuestos. [9] Los datos obtenidos de microorganismos podrían establecer procesos de cultivo en el futuro. [10] Algunas de las herramientas de ensamblaje del genoma que se pueden utilizar en la secuenciación del genoma de una sola célula incluyen: SPAdes , IDBA-UD, Cortex y HyDA. [11]
Métodos
Se ha publicado una lista de más de 100 métodos ómicos unicelulares diferentes . [12]
La amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) es una técnica ampliamente utilizada que permite amplificar femtogramos de ADN de una bacteria a microgramos para el uso de secuenciación. Los reactivos necesarios para las reacciones MDA incluyen: cebadores aleatorios y ADN polimerasa del bacteriófago phi29. En una reacción isotérmica de 30 grados, el ADN se amplifica con los reactivos incluidos. A medida que las polimerasas fabrican nuevas hebras, se produce una reacción de desplazamiento de hebras que sintetiza múltiples copias de cada plantilla de ADN. Al mismo tiempo, las hebras que se extendieron con anterioridad serán desplazadas. Los productos MDA dan como resultado una longitud de aproximadamente 12 kb y rangos de hasta alrededor de 100 kb, lo que permite su uso en la secuenciación de ADN. [10] En 2017, se introdujo una mejora importante de esta técnica, llamada WGA-X, aprovechando un mutante termoestable de la polimerasa phi29, lo que conduce a una mejor recuperación del genoma de células individuales, en particular aquellas con alto contenido de G + C . [13] La MDA también se ha implementado en un sistema basado en gotas de microfluidos para lograr una amplificación del genoma completo de una sola célula altamente paralelizada. Al encapsular células individuales en gotitas para la captura y amplificación de ADN, este método ofrece un sesgo reducido y un rendimiento mejorado en comparación con el MDA convencional. [14]
Otro método común es MALBAC . [15] Este método comienza con la amplificación isotérmica como se hace en MDA, pero los cebadores están flanqueados por una secuencia "común" para la amplificación por PCR en sentido descendente. A medida que se generan los amplicones preliminares, la secuencia común promueve la autoligación y la formación de "bucles" para evitar una mayor amplificación. A diferencia de la MDA, no se forma la red de ADN altamente ramificada. En cambio, en otro ciclo de temperatura, los bucles se desnaturalizan, lo que permite que los fragmentos se amplifiquen con PCR. MALBAC también se ha implementado en un dispositivo de microfluidos, pero el rendimiento de amplificación no mejoró significativamente mediante la encapsulación en gotitas de nanolitros. [dieciséis]
Comparando MDA y MALBAC, MDA da como resultado una mejor cobertura del genoma, pero MALBAC proporciona una cobertura más uniforme en todo el genoma. MDA podría ser más eficaz para identificar SNP , mientras que se prefiere MALBAC para detectar variantes de número de copias. Si bien la realización de MDA con un dispositivo de microfluidos reduce notablemente el sesgo y la contaminación, la química involucrada en MALBAC no demuestra el mismo potencial para mejorar la eficiencia.
Un método que está ganando popularidad para el análisis de la variación estructural genómica es la secuenciación de la hebra de la plantilla de ADN de una sola célula (también conocida como Strand-seq). [17] Utilizando el principio de procesamiento de tres canales de una sola celda, que utiliza el modelado conjunto de orientación de lectura, profundidad de lectura y fase de haplotipo, Strand-seq permite el descubrimiento de todas las clases de variación estructural ≥ 200 kb de tamaño. Strand-seq supera varias limitaciones de los métodos basados en la amplificación del genoma completo para la identificación de clases de variación genética somática en células individuales, [18] porque no es susceptible a los llamados chimeneas de lectura que conducen a llamadas de variación estructural falsas cuando se utilizan los métodos anteriores (discutido en detalle en la sección siguiente). La elección del método depende del objetivo de la secuenciación porque cada método presenta diferentes ventajas. [7]
Limitaciones
La MDA de los genomas de células individuales da como resultado una cobertura genómica muy desigual, es decir, una sobrerrepresentación relativa y una subrepresentación de varias regiones de la plantilla, lo que conduce a la pérdida de algunas secuencias. Hay dos componentes en este proceso: a) sobreamplificación estocástica y subamplificación de regiones aleatorias; yb) sesgo sistemático contra regiones de alto% GC. El componente estocástico se puede abordar agrupando reacciones de MDA unicelulares del mismo tipo de célula, empleando hibridación in situ fluorescente (FISH) y / o confirmación posterior a la secuenciación. [10] El sesgo de MDA contra regiones de alto% GC se puede abordar mediante el uso de polimerasas termoestables, como en el proceso llamado WGA-X. [13]
Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), que son una gran parte de la variación genética en el genoma humano , y la variación del número de copias (CNV), plantean problemas en la secuenciación de una sola célula, así como la cantidad limitada de ADN extraído de una sola célula. Debido a las escasas cantidades de ADN, el análisis preciso del ADN plantea problemas incluso después de la amplificación, ya que la cobertura es baja y es susceptible a errores. Con MDA, la cobertura del genoma promedio es inferior al 80% y los SNP que no están cubiertos por las lecturas de secuenciación se excluirán. Además, MDA muestra una alta proporción de abandono de alelos , sin detectar alelos de muestras heterocigotas. Actualmente se utilizan varios algoritmos SNP, pero ninguno es específico para la secuenciación de células individuales. La MDA con CNV también plantea el problema de identificar CNV falsas que ocultan las CNV reales. Para resolver esto, cuando se pueden generar patrones a partir de CNV falsas, los algoritmos pueden detectar y erradicar este ruido para producir variantes verdaderas. [19]
Strand-seq supera varias limitaciones de los métodos basados en la amplificación del genoma completo para la llamada de variantes genéticas. Dado que Strand-seq no requiere lecturas (o pares de lecturas) que atraviesen los límites (o puntos de corte) de las CNV, es menos susceptible a los artefactos comunes de los métodos unicelulares basados en la amplificación del genoma completo, es decir, el abandono de llamadas de variantes debido a la lee en el punto de interrupción de la variante, así como la llamada quimera de lectura, conocida por confundir el análisis de variación estructural en celdas individuales. [7] [18] Por esta razón, Strand-seq permite detectar de manera eficiente todas las clases de variación estructural de al menos 200 kb de tamaño, incluidos los ciclos de ruptura-fusión-puente y los eventos de cromotripsis , así como inversiones equilibradas y número de copias. traslocaciones equilibradas o desequilibradas. [18] "Además, las llamadas de variantes estructurales realizadas por Strand-seq se resuelven mediante un haplotipo de longitud de cromosoma que confiere especificidad adicional. [18] Como limitación, Strand-seq requiere la división de células para el etiquetado específico de la hebra con bromodeoxiuridina (BrdU) y el método no detecta variantes genéticas de tamaño inferior a 200 kb, como inserciones de elementos móviles .
Aplicaciones
Los microbiomas se encuentran entre los principales objetivos de la genómica unicelular debido a la dificultad de cultivar la mayoría de los microorganismos en la mayoría de los entornos. La genómica unicelular es una forma poderosa de obtener secuencias del genoma microbiano sin cultivo. Este enfoque se ha aplicado ampliamente en microbiomas marinos, del suelo, del subsuelo, de organismos y de otros tipos para abordar una amplia gama de cuestiones relacionadas con la ecología microbiana, la evolución, la salud pública y el potencial biotecnológico. [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28]
La secuenciación del cáncer también es una aplicación emergente de scDNAseq. Los tumores frescos o congelados pueden analizarse y categorizarse con respecto a SCNA, SNV y reordenamientos bastante bien utilizando enfoques de DNAS de genoma completo. [29] La scDNAseq del cáncer es particularmente útil para examinar la profundidad de la complejidad y las mutaciones compuestas presentes en dianas terapéuticas amplificadas, como los genes del receptor de tirosina quinasa (EGFR, PDGFRA, etc.) donde los enfoques convencionales a nivel de población del tumor en masa no pueden resolverse los patrones de co-ocurrencia de estas mutaciones dentro de las células individuales del tumor. Tal superposición puede proporcionar redundancia de la activación de la vía y la resistencia de las células tumorales.
Secuenciación del metiloma de ADN de una sola célula
La secuenciación del metiloma de ADN de una sola célula cuantifica la metilación del ADN . Hay varios tipos conocidos de metilación que ocurren en la naturaleza, incluyendo 5-metilcitosina (5mC), 5-hidroimetilcitosina (5hmC), 6-metiladenina (6mA) y 4mC 4-metilcitosina (4mC). En eucariotas, especialmente en animales, 5mC está muy extendido a lo largo del genoma y juega un papel importante en la regulación de la expresión génica al reprimir los elementos transponibles . [31] La secuenciación de 5mC en células individuales puede revelar cómo los cambios epigenéticos en células genéticamente idénticas de un solo tejido o población dan lugar a células con diferentes fenotipos.
Métodos
La secuenciación de bisulfito se ha convertido en el estándar de oro en la detección y secuenciación de 5mC en células individuales. [32] El tratamiento del ADN con bisulfito convierte los residuos de citosina en uracilo, pero no afecta a los residuos de 5-metilcitosina. Por lo tanto, el ADN que ha sido tratado con bisulfito retiene solo citosinas metiladas. Para obtener la lectura del metiloma, la secuencia tratada con bisulfito se alinea con un genoma no modificado. La secuenciación de bisulfito del genoma completo se logró en células individuales en 2014. [33] El método supera la pérdida de ADN asociada con el procedimiento típico, donde se agregan adaptadores de secuenciación antes de la fragmentación del bisulfito. En cambio, los adaptadores se agregan después de que el ADN se trata y se fragmenta con bisulfito, lo que permite que todos los fragmentos se amplifiquen mediante PCR. [34] Usando secuenciación profunda, este método captura ~ 40% del total de CpG en cada celda. Con la tecnología existente, el ADN no se puede amplificar antes del tratamiento con bisulfito, ya que la polimerasa no copiará las marcas de 5 mC.
La secuenciación de bisulfito de representación reducida de una sola célula (scRRBS) es otro método. [35] Este método aprovecha la tendencia de las citosinas metiladas a agruparse en islas CpG (CGI) para enriquecer áreas del genoma con un alto contenido de CpG. Esto reduce el costo de secuenciación en comparación con la secuenciación de bisulfito del genoma completo, pero limita la cobertura de este método. Cuando se aplica RRBS a muestras a granel, se detecta la mayoría de los sitios CpG en los promotores de genes, pero los sitios en los promotores de genes solo representan el 10% de los sitios CpG en todo el genoma. [36] En celdas individuales, se detecta el 40% de los sitios CpG de la muestra global. Para aumentar la cobertura, este método también se puede aplicar a un pequeño grupo de celdas individuales. En una muestra de 20 células individuales agrupadas, se detectaron el 63% de los sitios CpG de la muestra a granel. La combinación de células individuales es una estrategia para aumentar la cobertura del metiloma, pero a costa de ocultar la heterogeneidad en la población de células.
Limitaciones
Si bien la secuenciación con bisulfito sigue siendo el método más utilizado para la detección de 5 mC, el tratamiento químico es severo y fragmenta y degrada el ADN. Este efecto se agrava cuando se pasa de muestras a granel a celdas individuales. Otros métodos para detectar la metilación del ADN incluyen enzimas de restricción sensibles a la metilación. Las enzimas de restricción también permiten la detección de otros tipos de metilación, como 6mA con DpnI. [37] La secuenciación basada en nanoporos también ofrece una ruta para la secuenciación de metilación directa sin fragmentación o modificación del ADN original. La secuenciación de nanoporos se ha utilizado para secuenciar los metilomas de las bacterias, que están dominados por 6mA y 4mC (a diferencia de 5mC en eucariotas), pero esta técnica aún no se ha reducido a células individuales. [38]
Aplicaciones
La secuenciación de metilación de ADN de una sola célula se ha utilizado ampliamente para explorar diferencias epigenéticas en células genéticamente similares. Para validar estos métodos durante su desarrollo, los datos del metiloma unicelular de una población mixta se clasificaron con éxito por agrupamiento jerárquico para identificar distintos tipos de células. [35] Otra aplicación es estudiar células individuales durante las primeras divisiones celulares en el desarrollo temprano para comprender cómo los diferentes tipos de células emergen de un solo embrión. [39] La secuenciación de bisulfito del genoma completo de una sola célula también se ha utilizado para estudiar tipos de células raras pero muy activas en el cáncer, como las células tumorales circulantes (CTC). [40]
Ensayo unicelular para cromatina accesible a transposasa con secuenciación (scATAC-seq)
La secuenciación de cromatina accesible a transposasa de una sola célula mapea la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. Una transposasa inserta adaptadores de secuenciación directamente en regiones abiertas de cromatina, lo que permite amplificar y secuenciar esas regiones. [41]
Secuenciación del transcriptoma unicelular (scRNA-seq)
Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis de secuencia de ARN a granel , analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones de células. En poblaciones de células mixtas, estas medidas pueden ocultar diferencias críticas entre células individuales dentro de estas poblaciones. [42] [43]
La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) proporciona los perfiles de expresión de las células individuales y se considera el estándar de oro para definir los estados y fenotipos celulares a partir de 2020. [44] Aunque no es posible obtener información completa sobre cada ARN expresado por Cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, los patrones de expresión génica pueden identificarse mediante análisis de agrupamiento de genes . [45] Esto puede revelar la existencia de tipos de células raras dentro de una población celular que tal vez nunca antes se hayan visto. Por ejemplo, dos grupos que realizaron scRNA-Seq en el epitelio de las vías respiratorias del pulmón identificaron en 2018 células especializadas raras en el pulmón llamadas ionocitos pulmonares que expresan el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística . [46] [47]
Métodos
Los protocolos actuales de scRNA-seq implican aislar células individuales y su RNA, y luego seguir los mismos pasos que el RNA-seq masivo: transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Los primeros métodos separaban las células individuales en pocillos separados; Los métodos más recientes encapsulan células individuales en gotitas en un dispositivo de microfluidos, donde tiene lugar la reacción de transcripción inversa, convirtiendo los ARN en ADNc. Cada gota lleva un "código de barras" de ADN que marca de manera única los ADNc derivados de una sola célula. Una vez que se completa la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para secuenciar; las transcripciones de una celda en particular se identifican mediante un código de barras único. [48] [49]
Los desafíos para scRNA-Seq incluyen preservar la abundancia relativa inicial de mRNA en una célula e identificar transcripciones raras. [50] El paso de transcripción inversa es fundamental ya que la eficiencia de la reacción RT determina qué cantidad de la población de ARN de la célula será finalmente analizada por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3 'o 5' de los genes.
En la etapa de amplificación, actualmente se usa PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, también se pueden amplificar exponencialmente diferentes eficiencias de PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura de retroceso), produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, mientras que las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por PCR, las secuencias específicas pueden transcribirse de manera ineficaz, provocando así la pérdida de secuencia o generando secuencias incompletas. [1] [42] Se han publicado varios protocolos de scRNA-seq: Tang et al., [51] STRT, [52] SMART-seq, [53] CEL-seq, [54] RAGE-seq, [55] Quartz -seq. [56] y C1-CAGE. [57] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, síntesis y amplificación de ADNc, y la posibilidad de acomodar códigos de barras específicos de secuencia (es decir, UMI ) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [58]
En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente el ARNm de una sola célula y la expresión de proteínas a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [59] y CITE-seq. [60]
Limitaciones
La mayoría de los métodos de RNA-Seq dependen de la captura de la cola de poli (A) para enriquecer el mRNA y agotar el rRNA abundante y no informativo. Por tanto, a menudo se limitan a secuenciar moléculas de ARNm poliadeniladas. Sin embargo, estudios recientes están empezando a apreciar la importancia del ARN no poli (A), como el ARN no codificante largo y los microARN en la regulación de la expresión génica. Small-seq es un método unicelular que captura ARN pequeños (<300 nucleótidos) como microARN, fragmentos de ARNt y ARN nucleolares pequeños en células de mamíferos. [61] Este método utiliza una combinación de “máscaras de oligonucleótidos” (que inhiben la captura de moléculas de ARNr 5.8S muy abundantes) y selección de tamaño para excluir especies de ARN grandes, como otras moléculas de ARNr muy abundantes. Para apuntar a ARN no poli (A) más grandes, como ARNm largo no codificante, ARNm de histona, ARN circular y ARN potenciador, la selección de tamaño no es aplicable para agotar las moléculas de ARN ribosómico altamente abundantes (ARNr 18S y 28s). [62] RamDA-Seq de célula única es un método que logra esto mediante la realización de transcripción inversa con cebado aleatorio (amplificación de desplazamiento aleatorio) en presencia de cebadores "no tan aleatorios" (NSR) diseñados específicamente para evitar el cebado en la molécula de ARNr. [63] Si bien este método captura con éxito transcripciones de ARN total de longitud completa para secuenciar y detecta una variedad de ARN no poli (A) con alta sensibilidad, tiene algunas limitaciones. Los cebadores NSR se diseñaron cuidadosamente de acuerdo con las secuencias de ARNr en el organismo específico (ratón), y diseñar nuevos conjuntos de cebadores para otras especies requeriría un esfuerzo considerable. Recientemente, un método basado en CRISPR llamado scDASH (agotamiento unicelular de secuencias abundantes por hibridación) demostró otro enfoque para agotar las secuencias de rRNA de las bibliotecas de RNA-seq totales de una sola célula. [64]
Las bacterias y otros procariotas actualmente no son susceptibles de RNA-seq de una sola célula debido a la falta de mRNA poliadenilado. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de secuencia de ARN de una sola célula que no dependan de la captura de la cola de poli (A) también será fundamental para permitir estudios de microbioma de resolución de una sola célula. Los estudios de bacterias a granel suelen aplicar el agotamiento general del ARNr para superar la falta de ARNm poliadenilado en las bacterias, pero a nivel de una sola célula, el ARN total que se encuentra en una célula es demasiado pequeño. [62] La falta de ARNm poliadenilado y la escasez de ARN total que se encuentra en células de una sola bacteria son dos barreras importantes que limitan el despliegue de scRNA-seq en bacterias.
Aplicaciones
scRNA-Seq se está utilizando ampliamente en disciplinas biológicas como Biología del desarrollo , [65] Neurología , [66] Oncología , [67] [68] [69] Inmunología , [70] [71] Investigación cardiovascular [72] y Enfermedades infecciosas . [73] [74]
Utilizando métodos de aprendizaje automático , se han utilizado datos de RNA-Seq a granel para aumentar la relación señal / ruido en scRNA-Seq. Específicamente, los científicos han utilizado perfiles de expresión génica de conjuntos de datos de cáncer para construir redes de coexpresión , y luego los han aplicado en perfiles de expresión génica de una sola célula, obteniendo un método más robusto para detectar la presencia de mutaciones en células individuales utilizando niveles de transcripción. [75]
También se han aplicado algunos métodos de scRNA-seq a microorganismos unicelulares. SMART-seq2 se ha utilizado para analizar microbios eucariotas unicelulares, pero como se basa en la captura de la cola poli (A), no se ha aplicado en células procariotas. [76] Se han utilizado enfoques microfluídicos como Drop-seq y los dispositivos Fluidigm IFC-C1 para secuenciar parásitos de la malaria o células de levadura individuales. [77] [78] El estudio de levadura unicelular buscó caracterizar la tolerancia heterogénea al estrés en células de levadura isogénicas antes y después de que la levadura se exponga al estrés salino. El análisis de una sola célula de los diversos factores de transcripción mediante scRNA-seq reveló heterogeneidad en toda la población. Estos resultados sugieren que la regulación varía entre los miembros de una población para aumentar las posibilidades de supervivencia de una fracción de la población.
El primer análisis del transcriptoma de una sola célula en una especie procariota se logró usando la enzima exonucleasa terminadora para degradar selectivamente el ARNr y la amplificación por círculo rodante (ARNm). [79] En este método, los extremos del ADN monocatenario se ligaron para formar un círculo, y el bucle resultante se utilizó luego como plantilla para la amplificación lineal del ARN. La biblioteca de producto final se analizó luego mediante microarrays, con bajo sesgo y buena cobertura. Sin embargo, RCA no se ha probado con RNA-seq, que normalmente emplea secuenciación de próxima generación. La secuencia de ARN unicelular para bacterias sería muy útil para estudiar microbiomas. Abordaría los problemas encontrados en los enfoques convencionales de metatranscriptómica masiva, como no capturar las especies presentes en baja abundancia y no resolver la heterogeneidad entre las poblaciones de células.
scRNA-Seq ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluido el gusano Caenorhabditis elegans , [80] y el planario regenerativo Schmidtea mediterranea [81] [82] y el ajolote Ambystoma mexicanum . [83] [84] Los primeros animales vertebrados que se cartografiaron de esta manera fueron el pez cebra [85] [86] [87] y Xenopus laevis . [88] En cada caso, se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula. La ciencia reconoció estos avances como el Avance del año 2018 . [89]
Consideraciones
Aislamiento de células individuales
Hay varias formas de aislar células individuales antes de la amplificación y secuenciación del genoma completo. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) es un enfoque ampliamente utilizado. Las células individuales también se pueden recolectar mediante micromanipulación, por ejemplo, mediante dilución en serie o usando una pipeta de parche o nanotubo para recolectar una sola célula. [15] [90] Las ventajas de la micromanipulación son la facilidad y el bajo costo, pero son laboriosas y susceptibles a la identificación errónea de los tipos de células bajo el microscopio. La microdisección por captura láser (LCM) también se puede utilizar para recolectar células individuales. Aunque LCM conserva el conocimiento de la ubicación espacial de una celda muestreada dentro de un tejido, es difícil capturar una sola celda completa sin recolectar también los materiales de las celdas vecinas. [42] [91] [92] Los métodos de alto rendimiento para el aislamiento de células individuales también incluyen microfluidos . Tanto los FACS como los microfluídicos son precisos, automáticos y capaces de aislar muestras insesgadas. Sin embargo, ambos métodos requieren primero separar las células de sus microambientes, lo que provoca perturbaciones en los perfiles transcripcionales en el análisis de expresión de ARN. [93] [94]
Número de células a analizar
scRNA-Seq
En términos generales, para un experimento típico de secuenciación de ARN celular a granel (ARN-seq), se generan diez millones de lecturas y se considera expresado un gen con un umbral superior al umbral de 50 lecturas por kb por millón de lecturas (RPKM). Para un gen de 1 kb de longitud, esto corresponde a 500 lecturas y un coeficiente mínimo de variación (CV) del 4% bajo el supuesto de la distribución de Poisson . Para una célula de mamífero típica que contiene 200.000 ARNm, es necesario combinar los datos de secuenciación de al menos 50 células individuales para lograr este valor CV mínimo. Sin embargo, debido a la eficiencia de la transcripción inversa y otros ruidos introducidos en los experimentos, se requieren más células para análisis de expresión precisos e identificación del tipo de célula. [42]
Ver también
- Análisis unicelular
- Transcriptómica unicelular
- Epigenómica unicelular
- secuencia ADN
Referencias
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