En el campo médico de la inmunología , nanoCLAMP ( CL ostridal A ntibody M imetic P roteins) reactivos de afinidad son recombinante de 15 kD de anticuerpos miméticos de proteínas seleccionadas para apretado, selectiva y suavemente la unión a moléculas diana reversible. [1] El andamio nanoCLAMP se basa en un módulo de unión de carbohidratos termoestable similar a IgG de la familia 32 (CBM32) de una hialuronidasa de Clostridium perfringens (toxina Mu). La forma de las nanoCLAMP se aproxima a un cilindro de aproximadamente 4 nm de longitud y 2,5 nm de diámetro, aproximadamente del mismo tamaño que un nanocuerpo ( PDB: 2W1Q ). Los nanoCLAMP para dianas específicas se generan variando las secuencias de aminoácidos y, a veces, la longitud de tres bucles adyacentes expuestos al disolvente que conectan las hebras beta que forman el pliegue beta-sándwich, lo que confiere afinidad de unión y especificidad para la diana. [1]
Los nanoCLAMP son los primeros miméticos de anticuerpos descritos como sensibles a poliol , [2] lo que significa que liberan sus objetivos tras la exposición a una sal no caotrópica y un poliol , como el propilenglicol . [1] [3] Se ha demostrado que esta propiedad es útil para purificar proteínas funcionales y complejos proteicos mediante purificación por afinidad . Los nanoCLAMP se producen fácilmente en el citoplasma de E. coli , con rendimientos típicos en el rango de 50 a 300 mg / L de cultivo. Porque las nanoCLAMP están desprovistas de cisteínas, se puede usar una cisteína C-terminal diseñada para la conjugación dirigida al sitio de entidades como fluoróforos o resinas usando química de tiol .
Los nanoCLAMP se desarrollaron en los laboratorios de Nectagen. nanoCLAMP de presentación de fagos de bibliotecas se construyeron que contenía variaciones en 16 superficie amino ácidos en tres bucles con diversidades funcionales de aproximadamente 10 9 variantes. Estas bibliotecas se han examinado en busca de aglutinantes para proteínas y péptidos diana , lo que normalmente produce entre 1 y 30 aglutinantes únicos para la diana. [1]
Los nanoCLAMP purificados que contienen una sola cisteína C-terminal se pueden conjugar fácilmente con resinas de agarosa activadas con halo-acetilo en condiciones nativas o desnaturalizantes, y el enlace tioéter resultante hace que las resinas sean a prueba de lixiviación. Los objetivos se pueden purificar hasta una aparente homogeneidad en un solo paso. La naturaleza de respuesta a poliol [2] de las resinas permite eluir las dianas con sulfato de amonio 0,75 M y propilenglicol al 40% a pH 7,9, condiciones que han demostrado preservar la estructura nativa y los complejos proteicos . [1] [3] [4] [5] [6]
Se han producido nanoCLAMP que se dirigen a la proteína verde fluorescente (GFP) , mCherry , SUMO (SMT3) , NusA, avidina , NeutrAvidina , proteína de unión a maltosa (MBP) , tiorredoxina 1, beta-galactosidasa , SlyD y otras. Las capacidades de unión típicas de las resinas varían de 1 a 4 mg / ml de resina. Debido a que los nanoCLAMP se pliegan fácilmente, las resinas nanoCLAMP se pueden regenerar varias veces usando cloruro de guanidinio para limpiar la resina. [1]