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Un flujo de trabajo típico de un experimento de huellas dactilares en masa de péptidos.

La huella dactilar de masa de péptidos ( PMF ) (también conocida como huella dactilar de proteínas ) es una técnica analítica para la identificación de proteínas en la que la proteína desconocida de interés se escinde primero en péptidos más pequeños , cuyas masas absolutas se pueden medir con precisión con un espectrómetro de masas como MALDI-TOF o ESI-TOF . [1] El método fue desarrollado en 1993 por varios grupos de forma independiente. [2] [3] [4] [5] [6]Las masas de péptidos se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas o incluso con el genoma. Esto se logra mediante el uso de programas informáticos que traducen el genoma conocido del organismo en proteínas, luego, teóricamente, cortan las proteínas en péptidos y calculan las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. Luego comparan las masas de péptidos de la proteína desconocida con las masas teóricas de péptidos de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados se analizan estadísticamente para encontrar la mejor coincidencia.

La ventaja de este método es que solo deben conocerse las masas de los péptidos. La secuenciación de péptidos de novo que consume mucho tiempo es entonces innecesaria. Una desventaja es que la secuencia de proteínas debe estar presente en la base de datos de interés. Además, la mayoría de los algoritmos de PMF asumen que los péptidos provienen de una sola proteína. [7] La presencia de una mezcla puede complicar significativamente el análisis y potencialmente comprometer los resultados. Típico para la identificación de proteínas basada en PMF es el requisito de una proteína aislada. Las mezclas que exceden un número de 2-3 proteínas típicamente requieren el uso adicional de identificación de proteínas basada en MS / MS para lograr suficiente especificidad de identificación (6). Por lo tanto, las muestras típicas de PMF son proteínas aisladas deelectroforesis en gel bidimensional (geles 2D) o bandas SDS-PAGE aisladas . Los análisis adicionales por MS / MS pueden ser directos, p. Ej., Análisis MALDI-TOF / TOF o análisis nanoLC-ESI-MS / MS aguas abajo de eluidos de manchas de gel. [7] [8]

Orígenes [ editar ]

Debido al largo y tedioso proceso de análisis de proteínas, se desarrolló la toma de huellas dactilares de masas de péptidos. La degradación de Edman se utilizó en el análisis de proteínas y se requirió casi una hora para analizar un residuo de aminoácido. [9] SDS-PAGE también se utilizó para separar proteínas en mezclas muy complejas, que también emplearon métodos de electrotransferencia y tinción. [10] Luego, las bandas se extraerían del gel y se secuenciarían automáticamente. Un problema recurrente en el proceso era que las proteínas interferentes también se purificaban con la proteína de interés. Las secuencias de estas proteínas interferentes se compilaron en lo que se conoció como la base de datos Dayhoff. [11] En última instancia, tener las secuencias de estos contaminantes proteicos conocidos en las bases de datos disminuyó el tiempo del instrumento y los gastos involucrados en el análisis de proteínas.

Preparación de la muestra [ editar ]

Las muestras de proteínas pueden derivarse de SDS-PAGE [7] o HPLC de fase reversa , y luego están sujetas a algunas modificaciones químicas. Los puentes disulfuro en las proteínas se reducen y los aminoácidos de cisteína se carbamidometilan químicamente o se acrilamidan durante la electroforesis en gel.

Luego, las proteínas se cortan en varios fragmentos utilizando enzimas proteolíticas como tripsina , quimotripsina o Glu-C . Una muestra típica: proteasa relación es 50: 1. La proteólisis se lleva a cabo típicamente durante la noche y los péptidos resultantes se extraen con acetonitrilo y se secan al vacío. A continuación, los péptidos se disuelven en una pequeña cantidad de agua destilada o se concentran y purifican más y están listos para el análisis espectrométrico de masas.

Análisis espectrométrico de masas [ editar ]

La proteína digerida se puede analizar con diferentes tipos de espectrómetros de masas como ESI-TOF o MALDI-TOF . MALDI-TOF es a menudo el instrumento preferido porque permite un alto rendimiento de la muestra y se pueden analizar varias proteínas en un solo experimento, si se complementa con un análisis MS / MS . LC / ESI-MS y CE / ESI-MS también son excelentes técnicas para la toma de huellas dactilares de masas de péptidos. [12] [13]

Se pipetea una pequeña fracción del péptido (generalmente 1 microlitro o menos) en un objetivo MALDI y se agrega una sustancia química llamada matriz a la mezcla de péptidos. Matrices comunes son ácido sinapínico , ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico , y ácido 2,3-dihidroxibenzoico . Las moléculas de la matriz son necesarias para la desorción de las moléculas de péptidos. Las moléculas de matriz y péptido cocristalizan en el objetivo MALDI y están listas para ser analizadas. Existe una técnica de preparación de muestras predominantemente MALDI-MS, a saber, la técnica de gotas secas. [14]La diana se inserta en la cámara de vacío del espectrómetro de masas y la desorción e ionización de los fragmentos de polipéptido se inicia mediante un rayo láser pulsado que transfiere grandes cantidades de energía a las moléculas de la matriz. La transferencia de energía es suficiente para promover la ionización y la transición de moléculas de matriz y péptidos de la fase sólida a la fase gaseosa. Los iones se aceleran en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones donde su llegada se detecta como una señal eléctrica. Su relación masa-carga es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) en el tubo de deriva y se puede calcular en consecuencia.

El acoplamiento de ESI con LC capilar puede separar péptidos de digestiones de proteínas, mientras se obtienen sus masas moleculares al mismo tiempo. [15] La electroforesis capilar junto con ESI-MS es otra técnica; sin embargo, funciona mejor cuando se analizan pequeñas cantidades de proteínas. [13]

Análisis computacional [ editar ]

El análisis de espectrometría de masas produce una lista de pesos moleculares de los fragmentos que a menudo se denomina lista de picos. Las masas de péptidos se comparan con bases de datos de proteínas como Swissprot , que contienen información sobre la secuencia de proteínas. El software realiza digestiones in silico de las proteínas de la base de datos con la misma enzima (por ejemplo, tripsina) utilizada en la reacción de escisión química. A continuación, se calcula la masa de estos fragmentos de péptidos y se compara con la lista de picos de masas de péptidos medidas. Los resultados se analizan estadísticamente y las posibles coincidencias se devuelven en una tabla de resultados.

Ver también [ editar ]

  • Espectrometría de masas de proteínas
  • Proteómica de escopeta
  • Proteómica de arriba hacia abajo
  • Proteómica ascendente

Referencias [ editar ]

  1. ^ Clauser KR, Baker P, Burlingame AL (1999). "Papel de la medición de masa precisa (+/- 10 ppm) en las estrategias de identificación de proteínas que emplean MS o MS / MS y búsqueda de bases de datos". Anal. Chem . 71 (14): 2871–82. doi : 10.1021 / ac9810516 . PMID  10424174 .
  2. ^ Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ (1993). "Identificación rápida de proteínas por huella de péptido-masa". Curr. Biol . 3 (6): 327–32. doi : 10.1016 / 0960-9822 (93) 90195-T . PMID 15335725 . 
  3. ^ Henzel WJ, Billeci TM, Stults JT, Wong SC, Grimley C, Watanabe C (1993). "Identificación de proteínas de geles bidimensionales mediante búsqueda de masa molecular de fragmentos de péptidos en bases de datos de secuencias de proteínas" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 90 (11): 5011–5. Código Bibliográfico : 1993PNAS ... 90.5011H . doi : 10.1073 / pnas.90.11.5011 . PMC 46643 . PMID 8506346 .  
  4. ^ Mann M, Højrup P, Roepstorff P (1993). "Uso de información de peso molecular espectrométrico de masas para identificar proteínas en bases de datos de secuencias". Espectrometría de masas biológica . 22 (6): 338–45. doi : 10.1002 / bms.1200220605 . PMID 8329463 . 
  5. ^ James P, Quadroni M, Carafoli E, Gonnet G (1993). "Identificación de proteínas mediante huellas dactilares de perfil de masa". Biochem. Biophys. Res. Comun . 195 (1): 58–64. doi : 10.1006 / bbrc.1993.2009 . PMID 8363627 . 
  6. ^ Yates JR, Speicher S, Griffin PR, Hunkapiller T (1993). "Mapas de masas de péptidos: un enfoque muy informativo para la identificación de proteínas". Anal. Biochem . 214 (2): 397–408. doi : 10.1006 / abio.1993.1514 . PMID 8109726 . 
  7. ↑ a b c Shevchenko A, Jensen ON, Podtelejnikov AV, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A, Boucherie H, Mann M (1996). "Vinculación del genoma y el proteoma por espectrometría de masas: identificación a gran escala de proteínas de levadura a partir de geles bidimensionales" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 93 (25): 14440–5. Código Bibliográfico : 1996PNAS ... 9314440S . doi : 10.1073 / pnas.93.25.14440 . PMC 26151 . PMID 8962070 .  
  8. ^ Wang W, Sun J, Nimtz M, Deckwer WD, Zeng AP (2003). "Identificación de proteínas a partir del análisis de electroforesis en gel bidimensional de Klebsiella pneumoniae mediante el uso combinado de datos de espectrometría de masas y secuencias del genoma sin procesar" . Ciencia del proteoma . 1 (1): 6. doi : 10.1186 / 1477-5956-1-6 . PMC 317362 . PMID 14653859 .  
  9. ^ Henzel, William J .; Watanabe, Colin; Stults, John T. (1 de septiembre de 2003). "Identificación de proteínas: los orígenes de la huella dactilar de masa de péptidos" . Revista de la Sociedad Estadounidense de Espectrometría de Masas . 14 (9): 931–942. doi : 10.1016 / S1044-0305 (03) 00214-9 . ISSN 1044-0305 . PMID 12954162 .  
  10. ↑ Matsudaira, P. (25 de julio de 1987). "Secuencia de cantidades picomol de proteínas electrotransferidas en membranas de difluoruro de polivinilideno". La Revista de Química Biológica . 262 (21): 10035–10038. ISSN 0021-9258 . PMID 3611052 .  
  11. ^ BC Orcutt; DG George; Dayhoff y MO (1983). "Sistemas de base de datos de secuencias de proteínas y ácidos nucleicos". Revisión anual de biofísica y bioingeniería . 12 (1): 419–441. doi : 10.1146 / annurev.bb.12.060183.002223 . PMID 6347043 . 
  12. ^ Moore, RE; Licklider, L .; Schumann, D .; Lee, TD (1 de diciembre de 1998). "Una interfaz de electropulverización a microescala que incorpora un soporte monolítico de poli (estireno-divinilbenceno) para el análisis en línea de cromatografía líquida / espectrometría de masas en tándem de péptidos y proteínas". Química analítica . 70 (23): 4879–4884. doi : 10.1021 / ac980723p . ISSN 0003-2700 . PMID 9852776 .  
  13. ↑ a b Whitmore, Colin D .; Gennaro, Lynn A. (1 de junio de 2012). "Métodos de espectrometría de masas de electroforesis capilar para el mapeo de péptidos trípticos de anticuerpos terapéuticos". Electroforesis . 33 (11): 1550-1556. doi : 10.1002 / elps.201200066 . ISSN 1522-2683 . PMID 22736356 .  
  14. ^ Thiede, Bernd (2005). "Toma de huellas dactilares en masa de péptidos". Métodos . 35 (3): 237–247. doi : 10.1016 / j.ymeth.2004.08.015 . PMID 15722220 . 
  15. ^ Dass, Chhabil (2007). Fundamentos de la espectrometría de masas contemporánea | Libros en línea de Wiley . doi : 10.1002 / 0470118490 . ISBN 9780470118498.

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