La amplificación de la polimerasa de recombinasa (RPA) es una alternativa isotérmica de un solo tubo a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Al agregar una enzima transcriptasa inversa a una reacción de RPA, puede detectar ARN y ADN , sin la necesidad de un paso separado para producir ADNc . [2] [3] [4] Debido a que es isotérmico , la RPA puede usar un equipo mucho más simple que la PCR, que requiere un termociclador.. Operar mejor a temperaturas de 37 a 42 ° C y seguir funcionando, aunque más lentamente, a temperatura ambiente significa que las reacciones de RPA pueden, en teoría, ejecutarse rápidamente simplemente sosteniendo un tubo. Esto convierte a la RPA en un candidato excelente para desarrollar pruebas moleculares rápidas y de bajo costo en el punto de atención. Se realizó una evaluación internacional de la calidad de la detección molecular del virus de la fiebre del Valle del Rift, así como las mejores pruebas de RT-PCR, detectando muestras menos concentradas perdidas por algunas pruebas de PCR y una prueba de RT-LAMP . [5] La RPA fue desarrollada y lanzada por TwistDx Ltd. (antes conocida como ASM Scientific Ltd), una empresa de biotecnología con sede en Cambridge, Reino Unido.
El proceso de RPA emplea tres enzimas centrales : una recombinasa , una proteína de unión al ADN (SSB) de una sola hebra y una polimerasa que desplaza la hebra .
Las recombinasas son capaces de emparejar cebadores oligonucleotídicos con secuencia homóloga en ADN dúplex. [1]
Finalmente, la polimerasa que desplaza la hebra comienza la síntesis de ADN donde el cebador se ha unido al ADN diana.
Al usar dos cebadores opuestos, al igual que la PCR, si la secuencia diana está realmente presente, se inicia una reacción de amplificación de ADN exponencial . No se requiere ninguna otra manipulación de la muestra, como fusión térmica o química, para iniciar la amplificación. A temperaturas óptimas (37-42 ° C), la reacción progresa rápidamente y da como resultado una amplificación del ADN específico desde unas pocas copias diana hasta niveles detectables, generalmente en 10 minutos, para la detección rápida de ADN o ARN genómico viral, [2] [ 3] [4] [6] [7] [8] ADN genómico bacteriano patógeno, [9] [10] así como ADN aptámero de longitud corta. [11]
Las tres enzimas RPA centrales se pueden complementar con otras enzimas para proporcionar una funcionalidad adicional. La adición de exonucleasa III permite el uso de una sonda exo para la detección de fluorescencia en tiempo real similar a la PCR en tiempo real. [1] La adición de endonucleasa IV significa que se puede usar una sonda nfo para la detección de la banda de flujo lateral de una amplificación exitosa. [1] [6] [12]Si se agrega una transcriptasa inversa que funciona a 37-42 ° C, entonces el ARN se puede transcribir de manera inversa y el ADNc producido se amplifica, todo en un solo paso. Actualmente, solo la versión TwistAmp exo de RPA está disponible con la transcriptasa inversa incluida, aunque los usuarios pueden simplemente complementar otras reacciones TwistAmp con una transcriptasa inversa para producir el mismo efecto. Al igual que con la PCR, todas las formas de reacciones de RPA se pueden multiplexar mediante la adición de más pares de cebador / sonda, lo que permite la detección de múltiples analitos o un control interno en el mismo tubo.