La transferencia Northern inversa es un método mediante el cual se pueden analizar los patrones de expresión génica comparando moléculas de ARN aisladas de una muestra de prueba con muestras en una biblioteca de ADNc de control. Es una variante de la transferencia Northern en la que el ácido nucleico inmovilizado en una membrana es una colección de fragmentos de ADN aislados en lugar de ARN , y la sonda es ARN extraído de un tejido y marcado radiactivamente. Se puede usar una transferencia Northern inversa para perfilar los niveles de expresión de conjuntos particulares de secuencias de ARN en un tejido o para determinar la presencia de una secuencia de ARN particular en una muestra. [1] Aunque los microarrays de ADN y las técnicas más nuevas de próxima generación generalmente han suplantado a la transferencia Northern inversa, todavía se utiliza hoy en día y proporciona un medio relativamente barato y fácil de definir la expresión de grandes conjuntos de genes.
Procedimiento
Para preparar la membrana norte inversa, las secuencias de ADNc para las transcripciones de interés se inmovilizan en membranas de nailon, lo que se puede lograr mediante el uso de transferencias puntuales o transferencia bidireccional en gel de agarosa y fijación UV del ADN a las membranas. En muchos casos, las sondas de ADNc pueden preferirse a las sondas de ARN para mitigar los problemas de degradación del ARN por las ARNas o metabolitos tisulares. [2] Las membranas de transferencia Northern inversa preparadas se hibridan previamente en solución de Denhardt con tampón SSC y las sondas de ADNc marcadas se desnaturalizan a 100 ° C y se añaden a la solución de prehibridación. La membrana se incuba con las sondas durante al menos 15 horas a 65 ° C, luego se lava y se expone. [3]
Aplicaciones
Cuantificación de niveles de expresión de ARNm
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/8/8d/Revnorthern1.jpg/440px-Revnorthern1.jpg)
La transferencia Northern inversa, al igual que la transferencia Northern en la que se basa, se usa para determinar los niveles de expresión génica en tejidos particulares. En comparación con la transferencia Northern, la transferencia Northern inversa es capaz de sondar un gran número de transcripciones a la vez con menos especificidad con respecto a las sondas que la requerida para la transferencia Northern. [4] A menudo, esto implicará el uso de bibliotecas de hibridación sustractiva de supresión (SSH) o presentación diferencial para aislar transcripciones expresadas diferencialmente y crear clones bacterianos que contengan inserciones para estas secuencias. Estos servirán como los objetivos hibridados a la membrana y serán probados por la muestra de ARN. Los niveles de expresión pueden cuantificarse aumentando o disminuyendo la señal fluorescente o radiactiva durante un tratamiento de control. [3] Las bandas o puntos que aparecen más oscuros y más grandes significan transcripciones que están sobreexpresadas en una muestra de interés y los puntos más claros indican que una transcripción está regulada a la baja en comparación con una muestra de control.
Confirmación de los resultados de la pantalla diferencial
Debido a la tendencia a generar un gran número de falsos positivos causada por la contaminación de la banda con secuencias heterogéneas, los aciertos de visualización diferencial deberán confirmarse mediante un método alternativo para determinar la expresión diferencial. [5] Si bien el Northern blot o q-PCR se utilizan a menudo para confirmar los resultados, ambas técnicas tienen inconvenientes. La transferencia Northern está limitada por su capacidad para sondear solo con un ARNm a la vez, mientras que la q-PCR requiere que las transcripciones sean lo suficientemente largas para generar cebadores para la secuencia y las sondas pueden ser costosas. Por lo tanto, el norte inverso se ha utilizado como un medio para confirmar los aciertos de DD-PCR, o secuencias con niveles de expresión alterados. En este caso, la membrana se recubrirá con productos de DD-PCR amplificados que se han clonado en vectores, secuenciados y reamplificados. [4]
Microarrays de ADN
Los microarrays de ADN operan mediante procedimientos similares a los usados en la transferencia Northern inversa, que consta de muchas sondas de ADN hibridadas con un sustrato sólido de vidrio, plástico o silicio que se sondea con ARN o ADNc marcado. Esto permite un perfil de expresión génica significativamente ampliado . [6] Las matrices se pueden comprar de proveedores comerciales adaptadas a las necesidades de investigación, por ejemplo, micromatrices de cáncer, ciclo celular o toxicología, o se pueden generar para objetivos personalizados. [7] Las señales fluorescentes o radiactivas generadas por la hibridación de sondas de ADNc de muestras aisladas serán proporcionales a la abundancia de la transcripción en el tejido que se está estudiando. [8]
Aplicaciones de investigación
- La transferencia del norte inversa se utilizó en un estudio de 2013 en Gene en el que el autor identificó una serie de genes responsables de la respuesta temprana de resistencia al frío en la fruta cítrica Poncirus trifoliata resistente al frío . Se formaron bibliotecas de hibridación sustractiva de supresión a partir de plantas de control y tratadas en frío y se secuenciaron e hibridaron clones de ADNc con una membrana, que se probó con ADNc marcado con DIG de plantas de control y tratadas en frío. Los genes que experimentaron una regulación positiva particularmente fuerte incluyeron genes para el rescate y la defensa celular, el metabolismo celular y la regulación transcripcional. Estos incluyeron Ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa activasa, que regula la enzima fotosintética RuBisCO, GAPDH, que participa en la respuesta de glucólisis y estrés oxidativo, así como la proteína de control de la división celular CDC91 y el gen de resistencia a enfermedades NBS-LLR. Estos resultados fueron luego confirmados por qPCR. [9]
- Un estudio utilizó la técnica para determinar diferencias en el tejido estriado en ratas tratadas con 3-NP, que a menudo se usa en experimentos para generar un fenotipo similar a la enfermedad de Huntington en ratas. Se usó hibridación sustractiva con supresión directa e inversa para generar perfiles de sobreexpresión y subexpresión de genes, y estas bibliotecas se usaron para borrar dos membranas. Aparte de la aparición de lesiones similares en los cerebros de rata disecados, el grupo observó un aumento significativo de la expresión de Profilin-2 (Pfn2) en el cuerpo estriado. Su sobreexpresión está relacionada con una disminución en la polimerización de actina y la consiguiente menor densidad de la espina dendrítica. [10]
Ver también
Referencias
- ^ Primrose, Sandy B .; Twyman, Richard (1 de abril de 2009). Principios de análisis genómico y genómica . John Wiley e hijos. ISBN 9781444311280.
- ^ Jaakola, Laura (2001). "La transferencia de CDNA ofrece un método alternativo para estudios de expresión génica". Reportero de Biología Molecular Vegetal . 19 (2): 125-128. doi : 10.1007 / BF02772154 .
- ^ a b Bowler, Dr. Chris (1 de enero de 2002). Biología vegetal molecular: un enfoque práctico . Prensa de la Universidad de Oxford. ISBN 9780199638185.
- ^ a b Dilks, Daniel W; Ring, Robert H; Khawaja, Xavier Z; Novak, Thomas J; Aston, Christopher (15 de febrero de 2003). "Confirmación de alto rendimiento de los resultados de la PCR de presentación diferencial mediante transferencia Northern inversa". Revista de métodos de neurociencia . 123 (1): 47–54. CiteSeerX 10.1.1.333.8554 . doi : 10.1016 / S0165-0270 (02) 00343-6 . PMID 12581848 .
- ^ Callard, D .; Lescure, B .; Mazzolini, L. (1994). "Un método para la eliminación de falsos positivos generados por la técnica de presentación diferencial de ARNm". BioTechniques . 16 (6): 1096–7, 1100–3. PMID 7521188 .
- ^ Tomar, Rukam S. (15 de enero de 2010). Marcadores moleculares y biotecnología vegetal . New India Publishing. ISBN 9789380235257.
- ^ Kurnaz, Isil Aksan (8 de mayo de 2015). Técnicas en Ingeniería Genética . Prensa CRC. ISBN 9781482260908.
- ^ Offermanns, Stefan (14 de agosto de 2008). Enciclopedia de farmacología molecular . Springer Science & Business Media. ISBN 9783540389163.
- ^ Şahin-Çevik, Mehtap (10 de enero de 2013). "Análisis de identificación y expresión de genes tempranos inducidos por el frío de los cítricos resistentes al frío Poncirus trifoliata (L.) Raf". Gene . 512 (2): 536–545. doi : 10.1016 / j.gene.2012.09.084 . PMID 23026217 .
- ^ Chakraborty, J .; Pandey, M .; Navneet, AK; Appukuttan, TA; Varghese, M .; Sreetama, SC; Rajamma, U .; Mohanakumar, KP (2014). "Profilin-2 aumentó la expresión y su interacción alterada con β-actina en el cuerpo estriado de la enfermedad de Huntington inducida por ácido 3-nitropropiónico en ratas". Neurociencia . 281 : 216-228. doi : 10.1016 / j.neuroscience.2014.09.035 . PMID 25255934 .
enlaces externos
- Protocolo para visualización diferencial, análisis de expresión de qPCR y norte inverso
- cribado de la diferencia de expresión génica enriquecida por visualización diferencial
- Presentación que describe diferentes métodos de análisis de expresión génica