La inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) es un tipo de técnica experimental de inmunoprecipitación que se utiliza para investigar la interacción entre las proteínas y el ADN en la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas están asociadas con regiones genómicas específicas, como factores de transcripción en promotores u otros sitios de unión al ADN , y posiblemente definiendo cistromas . ChIP también tiene como objetivo determinar la ubicación específica en el genoma con la que se asocian varias modificaciones de histonas , lo que indica el objetivo de los modificadores de histonas. [1]
Brevemente, el método convencional es el siguiente:
- El ADN y las proteínas asociadas en la cromatina en células o tejidos vivos están reticulados (este paso se omite en Native ChIP).
- Los complejos de ADN-proteína (cromatina-proteína) luego se cortan en fragmentos de ADN de ~ 500 pb mediante sonicación o digestión con nucleasa.
- Los fragmentos de ADN reticulados asociados con la proteína o proteínas de interés se inmunoprecipitan selectivamente a partir de los restos celulares usando un anticuerpo específico de proteína apropiado.
- Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia. El enriquecimiento de secuencias de ADN específicas representa regiones del genoma con las que la proteína de interés está asociada in vivo .
ChIP típico
Existen principalmente dos tipos de chips, que se diferencian principalmente en la preparación de cromatina de partida. El primero utiliza cromatina reticulada reversiblemente cizallada por sonicación llamada ChIP reticulado (XChIP). Chip nativo (NChIP) utiliza la cromatina nativa cortado por micrococcal nucleasa digestión. [ cita requerida ]
ChIP reticulado (XChIP)
El chip entrecruzado es adecuado principalmente para mapear el ADN diana de factores de transcripción u otras proteínas asociadas a la cromatina, y utiliza cromatina entrecruzada reversiblemente como material de partida. El agente de reticulación reversible podría ser formaldehído [2] o luz ultravioleta . [3] Luego, la cromatina reticulada generalmente se cizalla mediante sonicación, lo que proporciona fragmentos de 300 a 1000 pares de bases (pb) de longitud. Se ha utilizado una reticulación de formaldehído suave seguida de digestión con nucleasa para cortar la cromatina. [4] Se ha demostrado que los fragmentos de cromatina de 400 a 500 pb son adecuados para los ensayos de ChIP, ya que cubren de dos a tres nucleosomas .
Los restos celulares en el lisado cizallado se eliminan por sedimentación y los complejos proteína-ADN se inmunoprecipitan selectivamente utilizando anticuerpos específicos contra la proteína o proteínas de interés. Los anticuerpos se acoplan comúnmente a agarosa , sefarosa o perlas magnéticas. Alternativamente, los complejos cromatina-anticuerpo se pueden retener y eluir selectivamente mediante discos poliméricos inertes. [5] [6] Los complejos inmunoprecipitados (es decir, el complejo de secuencia de ADN de grano-anticuerpo-proteína-objetivo) se recolectan y lavan para eliminar la cromatina unida de manera no específica, se invierte el entrecruzamiento proteína-ADN y se eliminan las proteínas por digestión con proteinasa K . Se puede usar una versión etiquetada con epítopo de la proteína de interés, o biotinilación in vivo [7] en lugar de anticuerpos contra la proteína nativa de interés.
El ADN asociado con el complejo se purifica e identifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), microarrays ( ChIP-on-chip ), clonación y secuenciación molecular o secuenciación directa de alto rendimiento ( ChIP-Seq ). [ cita requerida ]
Chip nativo (NChIP)
Native ChIP es principalmente adecuado para mapear el ADN objetivo de modificadores de histonas . Generalmente, la cromatina nativa se usa como cromatina de partida. A medida que las histonas se envuelven alrededor del ADN para formar nucleosomas, se unen naturalmente. Luego, la cromatina se cizalla mediante digestión con nucleasa microcócica, que corta el ADN a lo largo del conector, dejando los nucleosomas intactos y proporcionando fragmentos de ADN de un nucleosoma (200 pb) a cinco nucleosomas (1000 pb) de longitud. A partir de entonces, se utilizan métodos similares a XChIP para eliminar los restos celulares, inmunoprecipitar la proteína de interés, eliminar la proteína del complejo inmunoprecipado y purificar y analizar el ADN asociado al complejo. [ cita requerida ]
Comparación de XChIP y NChIP
La principal ventaja de NChIP es la especificidad de los anticuerpos . Es importante tener en cuenta que la mayoría de los anticuerpos de las histonas modificadas se generan contra antígenos peptídicos sintéticos no fijos y que los epítopos que necesitan reconocer en el XChIP pueden ser interrumpidos o destruidos por la reticulación de formaldehído , particularmente porque es probable que las reticulaciones implican grupos e-amino de lisina en los N-terminales, interrumpiendo los epítopos. Es probable que esto explique la eficiencia constantemente baja de los protocolos XChIP en comparación con NChIP.
Pero XChIP y NChIP tienen objetivos y ventajas diferentes entre sí. XChIP sirve para mapear sitios diana de factores de transcripción y otras proteínas asociadas a la cromatina; NChIP sirve para mapear los sitios de destino de los modificadores de histonas (consulte la Tabla 1).
Tabla 1 Ventajas y desventajas de NChIP y XChIP
XChIP | NChIP | |
---|---|---|
Ventajas | Adecuado para factores de transcripción o cualquier otra proteína asociada a cromatina de unión débil. Aplicable a cualquier organismo donde la proteína nativa sea difícil de preparar. | Especificidad de anticuerpos comprobable Mejor especificidad de anticuerpos como proteína diana naturalmente intacta Mejor eficiencia de recuperación de cromatina y proteínas debido a una mejor especificidad de anticuerpos |
Desventajas | Recuperación ineficaz de la cromatina debido a la alteración del epítopo de la proteína diana del anticuerpo Puede causar un resultado falso positivo debido a la fijación de proteínas transitorias a la cromatina Amplio rango de tamaño de cizallamiento de la cromatina debido al corte aleatorio por sonicación. | Por lo general, no es adecuado para proteínas que no son histonas. Los nucleosomas pueden reorganizarse durante la digestión. |
Historia y nuevos métodos de ChIP
En 1984, John T. Lis y David Gilmour, en ese momento un estudiante de posgrado en el laboratorio de Lis, usaron irradiación UV, un agente de entrecruzamiento de proteína-ácido nucleico de longitud cero, para entrecruzar covalentemente proteínas unidas al ADN en células bacterianas vivas. Tras la lisis de células reticuladas y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, el ADN asociado con la ARN polimerasa enriquecida se hibridó con sondas correspondientes a diferentes regiones de genes conocidos para determinar la distribución in vivo y la densidad de la ARN polimerasa en estos genes. Un año después, utilizaron la misma metodología para estudiar la distribución de la ARN polimerasa II eucariota en los genes de choque térmico de la mosca de la fruta. Estos informes se consideran los estudios pioneros en el campo de la inmunoprecipitación de cromatina. [8] [9] XChIP fue modificado y desarrollado aún más por Alexander Varshavsky y sus colaboradores, quienes examinaron la distribución de la histona H4 en los genes de choque térmico utilizando entrecruzamiento de formaldehído. [10] [11] Esta técnica se desarrolló y perfeccionó ampliamente a partir de entonces. [12] El enfoque NChIP fue descrito por primera vez por Hebbes et al ., 1988, [13] y también se desarrolló y perfeccionó rápidamente. [14] El ensayo de ChIP típico suele tardar de 4 a 5 días y requiere al menos 10 6 ~ 10 7 células. Ahora se podrían lograr nuevas técnicas en ChIP con tan solo 100 ~ 1000 células y completarse en un día.
- ChIP sin perlas : este método novedoso ChIP utiliza discos de polímero poroso inerte funcionalizado con Proteína A o G en columnas de centrifugación o microplacas. El disco retiene selectivamente el complejo cromatina-anticuerpo y se eluye para obtener ADN enriquecido para aplicaciones posteriores como qPCR y secuenciación. El entorno poroso está diseñado específicamente para maximizar la eficiencia de captura y reducir la unión no específica. Debido a la menor manipulación manual y los protocolos optimizados, el chip se puede realizar en 5 horas. [6]
- Carrier ChIP (CChIP): este enfoque podría usar tan solo 100 células agregando células de Drosophila como cromatina transportadora para reducir la pérdida y facilitar la precipitación de la cromatina objetivo. Sin embargo, exige cebadores muy específicos para la detección de la cromatina de la célula diana a partir del fondo de cromatina portadora extraña, y lleva de dos a tres días. [15]
- Fast ChIP (qChIP): el ensayo Fast ChIP redujo el tiempo al acortar dos pasos en un ensayo típico de ChIP: (i) un baño ultrasónico acelera la velocidad de unión del anticuerpo a las proteínas diana y, por lo tanto, reduce el tiempo de inmunoprecipitación (ii) una resina- El procedimiento de aislamiento de ADN basado en (Chelex-100) reduce el tiempo de reversión de entrecruzamiento y aislamiento de ADN. Sin embargo, el protocolo rápido es adecuado solo para muestras de células grandes (en el rango de 10 6 ~ 10 7 ). [16] [17] Se pueden procesar hasta 24 muestras de cromatina cizallada para producir ADN listo para PCR en 5 horas, lo que permite probar múltiples factores de cromatina simultáneamente y / o observar eventos genómicos en varios puntos de tiempo. [18]
- ChIP rápido y cuantitativo (Q 2 ChIP): el ensayo utiliza 100.000 células como material de partida y es adecuado para hasta 1000 ChIP de histonas o 100 ChIP de factor de transcripción. Por lo tanto, se pueden preparar y almacenar muchas muestras de cromatina en paralelo, y se puede realizar Q 2 ChIP en un día. [19]
- MicroChIP (µChIP): la cromatina generalmente se prepara a partir de 1000 células y se pueden realizar hasta 8 chips en paralelo sin portadores. El ensayo también puede comenzar con 100 células, pero solo es adecuado para un chip. También puede utilizar biopsias de tejido pequeñas (1 mm 3 ) y microChIP se puede realizar en un día. [20] [21]
- ChIP de matriz : este es un ensayo de ChIP basado en microplacas con un mayor rendimiento y un procedimiento simplificado. Todos los pasos se realizan en pocillos de microplacas sin transferencias de muestras, lo que permite un potencial de automatización. Permite 96 ensayos de chips para histonas y varias proteínas unidas al ADN en un solo día. [22]
- Patología-ChIP (PAT-ChIP): esta técnica permite el ChIP de tejidos patológicos fijados con formalina e incluidos en parafina y, por lo tanto, el uso de archivos de patología (incluso aquellos que tienen varios años) para análisis epigenéticos y la identificación de biomarcadores epigenéticos candidatos o objetivos. [23]
ChIP también se ha aplicado para el análisis de todo el genoma mediante la combinación con tecnología de microarrays ( ChIP-on-chip ) o tecnología de secuenciación de ADN de segunda generación ( Chip-Sequencing ). ChIP también se puede combinar con la secuenciación de etiquetas de extremo emparejado en el análisis de interacción de cromatina mediante la secuenciación de etiquetas de extremo emparejado (ChIA-PET), una técnica desarrollada para el análisis de novo a gran escala de estructuras de cromatina de orden superior. [24] [25] [26]
Limitaciones
- Los ensayos a gran escala que utilizan ChIP son un desafío utilizando organismos modelo intactos. Esto se debe a que deben generarse anticuerpos para cada TF o, alternativamente, es necesario producir organismos modelo transgénicos que expresan TF marcados con epítopo.
- Los investigadores que estudian patrones diferenciales de expresión génica en organismos pequeños también enfrentan problemas, ya que los genes se expresan en niveles bajos, en un número reducido de células, en una ventana de tiempo estrecha.
- Los experimentos de ChIP no pueden discriminar entre diferentes isoformas de TF (isoforma de proteína ).
Ver también
- ChIP-exo , una técnica que agrega tratamiento con exonucleasa al proceso de ChIP para obtener una resolución de hasta un solo par de bases de los sitios de unión
- ChIP-on-chip , combina ChIP con tecnología de microarrays
- DamID , una técnica de mapeo de ubicación alternativa que no requiere anticuerpos específicos
- RIP-Chip , una técnica similar para analizar las interacciones ARN-proteína
Referencias
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enlaces externos
- Cromatina + inmunoprecipitación en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- EpigenomeNOE.com
- Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) sobre cromatina no fijada de células y tejidos para analizar modificaciones de histonas
- Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de complejos proteicos: mapeo de objetivos genómicos de proteínas nucleares en células cultivadas