La replicación en círculo rodante ( RCA ) es un proceso de replicación unidireccional de ácidos nucleicos que puede sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN , como plásmidos , genomas de bacteriófagos y el genoma circular de ARN de viroides . Algunos virus eucariotas también replican su ADN o ARN a través del mecanismo del círculo rodante.
Como una versión simplificada de la replicación del círculo rodante natural , se desarrolló una técnica de amplificación de ADN isotérmica, la amplificación del círculo rodante. El mecanismo RCA se utiliza ampliamente en biología molecular y nanotecnología biomédica , especialmente en el campo de la biosensores (como método de amplificación de señales). [1]
Replicación circular del ADN
La replicación del ADN en círculo rodante se inicia mediante una proteína iniciadora codificada por el ADN del plásmido o bacteriófago, que corta una hebra de la molécula de ADN circular de doble hebra en un sitio llamado origen de doble hebra o DSO. La proteína iniciadora permanece unida al extremo fosfato 5 'de la hebra mellada, y el extremo hidroxilo 3' libre se libera para que sirva como cebador para la síntesis de ADN por la ADN polimerasa III . Utilizando la hebra sin cortar como plantilla, la replicación procede alrededor de la molécula de ADN circular, desplazando la hebra mellada como ADN monocatenario. El desplazamiento de la hebra mellada se lleva a cabo mediante una helicasa codificada por el huésped llamada PcrA (la abreviatura que significa copia de plásmido reducida) en presencia de la proteína de iniciación de la replicación del plásmido.
La síntesis continua de ADN puede producir múltiples copias lineales monocatenarias del ADN original en una serie continua de la cabeza a la cola llamada concatemer . Estas copias lineales se pueden convertir en moléculas circulares de doble cadena mediante el siguiente proceso:
Primero, la proteína iniciadora hace otro corte en el ADN para terminar la síntesis de la primera hebra (principal). La ARN polimerasa y la ADN polimerasa III luego replican el ADN de origen monocatenario (SSO) para formar otro círculo bicatenario. La ADN polimerasa I elimina el cebador, reemplazándolo con ADN, y la ADN ligasa une los extremos para formar otra molécula de ADN circular de doble hebra.
Como resumen, una replicación típica de un círculo rodante de ADN consta de cinco pasos: [2]
- El dsDNA circular será "mellado".
- El extremo 3 ' se alarga utilizando ADN "sin muescas" como cadena principal (plantilla); El extremo de 5 ' está desplazado.
- El ADN desplazado es una hebra rezagada y se hace de doble hebra a través de una serie de fragmentos de Okazaki .
- Replicación de ssDNA "no cortado" y desplazado.
- El ADN desplazado se circulariza.
Virología
Replicación del ADN viral
Algunos virus de ADN replican su información genómica en las células huésped mediante la replicación en círculo rodante. Por ejemplo, el virus del herpes humano-6 (HHV-6) (hibv) expresa un conjunto de "genes tempranos" que se cree que están involucrados en este proceso. [3] Los concatémeros largos que resultan se escinden posteriormente entre las regiones pac-1 y pac-2 del genoma del HHV-6 por las ribozimas cuando se empaquetan en viriones individuales. [4]
El virus del papiloma humano-16 (VPH-16) es otro virus que emplea la replicación rodante para producir progenie a un ritmo elevado. El VPH-16 infecta las células epiteliales humanas y tiene un genoma circular bicatenario. Durante la replicación, en el origen, el hexámero E1 envuelve el ADN de una sola hebra y se mueve en la dirección de 3 'a 5'. En la replicación bidireccional normal, las dos proteínas de replicación se disociarán en el momento de la colisión, pero en HPV-16 se cree que el hexámero E1 no se disocia, lo que conduce a una replicación continua. Se cree que este mecanismo de replicación del VPH puede tener implicaciones fisiológicas en la integración del virus en el cromosoma del hospedador y la progresión eventual al cáncer de cuello uterino. [5]
Además, geminivirus también utiliza la replicación de círculo rodante como mecanismo de replicación. Es un virus que se encarga de destruir muchos cultivos importantes, como la mandioca, el algodón, las legumbres, el maíz, el tomate y la okra. El virus tiene un ADN circular monocatenario que se replica en las células de la planta huésped. Todo el proceso es iniciado por la proteína iniciadora de la replicación geminiviral, Rep, que también es responsable de alterar el entorno del huésped para que actúe como parte de la maquinaria de replicación. Rep es también sorprendentemente similar a la mayoría de las otras proteínas iniciadoras de la replicación rodante de eubacterias, con la presencia de los motivos I, II y III en el extremo N terminal. Durante la replicación del círculo rodante, el ssDNA de geminivirus se convierte en dsDNA y Rep se une al dsDNA en la secuencia de origen TAATATTAC. Después de que Rep, junto con otras proteínas de replicación, se une al dsDNA, forma un bucle de tallo donde el ADN se escinde en la secuencia de nanómeros provocando un desplazamiento de la hebra. Este desplazamiento permite que la horquilla de replicación progrese en la dirección 3 'a 5', lo que finalmente produce una nueva hebra de ssDNA y una hebra de ADN concatemérica. [6]
Los intermediarios de replicación del ADN del bacteriófago T4 incluyen estructuras concateméricas circulares y circulares ramificadas . [7] Estas estructuras probablemente reflejan un mecanismo de replicación de círculo rodante.
Replicación de ARN viral
Algunos virus y viroides de ARN también replican su genoma a través de la replicación de ARN en círculo rodante. Para los viroides, hay dos vías alternativas de replicación de ARN que, respectivamente, siguieron miembros de la familia Pospivirodae (replicación asimétrica) y Avsunviroidae (replicación simétrica).
En la familia Pospiviroidae (similar a PSTVd), el ARN de cadena positiva circular es transcrito por una ARN polimerasa del huésped en cadenas negativas oligoméricas y luego cadenas positivas oligoméricas. [8] Estas hebras oligoméricas plus son escindidas por una RNasa del hospedador y ligadas por una ligasa de ARN del hospedador para reformar el ARN circular monomérico de hebra positiva. A esto se le llama la vía asimétrica de la replicación del círculo rodante. Los viroides de la familia Avsunviroidae (tipo ASBVd) replican su genoma a través de la vía simétrica de la replicación del círculo rodante. [9] En esta vía simétrica, las hebras negativas oligoméricas primero se escinden y ligan para formar hebras negativas monoméricas, y luego se transcriben en hebras positivas oligoméricas. A continuación, estas hebras oligoméricas plus se escinden y ligan para reformar la hebra monomérica plus. La vía de replicación simétrica se denominó porque tanto las hebras positivas como las negativas se producen de la misma manera.
La escisión de las hebras oligoméricas positivas y negativas está mediada por la estructura de ribozima de cabeza de martillo autoescindible presente en Avsunviroidae, pero tal estructura está ausente en Pospiviroidae. [10]
Amplificación del círculo rodante
La forma derivada de la replicación por círculo rodante se ha utilizado con éxito para la amplificación de ADN a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [1] Esta técnica de amplificación se denomina amplificación de círculo rodante (RCA). A diferencia de las técnicas de amplificación de ADN convencionales, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la RCA es una técnica de amplificación de ácido nucleico isotérmica en la que la polimerasa agrega continuamente nucleótidos individuales a un cebador hibridado a una plantilla circular que da como resultado un ADNss concatemero largo que contiene decenas a cientos. de repeticiones en tándem (complementarias a la plantilla circular). [11]
Hay cinco componentes importantes necesarios para realizar una reacción RCA:
- Una ADN polimerasa
- Un tampón adecuado que sea compatible con la polimerasa.
- Un cebador corto de ADN o ARN
- Una plantilla de ADN circular
- Trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP)
Las polimerasas utilizadas en RCA son Phi29 , Bst y Vent exo- DNA polimerasa para la amplificación del DNA y T7 RNA polimerasa para la amplificación del RNA. Dado que la ADN polimerasa Phi29 tiene la mejor procesividad y capacidad de desplazamiento de hebra entre todas las polimerasas mencionadas anteriormente, se ha utilizado con mayor frecuencia en reacciones de RCA. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RCA se puede realizar a una temperatura constante (temperatura ambiente a 65 ° C) tanto en solución libre como en la parte superior de los objetivos inmovilizados (amplificación en fase sólida).
Por lo general, hay tres pasos involucrados en una reacción de ADN RCA:
- Ligadura circular de plantilla, que puede realizarse mediante ligadura enzimática mediada por plantilla (p. Ej., Ligasa de ADN T4) o ligadura sin plantilla utilizando ligasas de ADN especiales (es decir, CircLigasa).
- Alargamiento de ADN monocatenario inducido por cebador . Pueden emplearse múltiples cebadores para hibridar con el mismo círculo. Como resultado, se pueden iniciar múltiples eventos de amplificación, produciendo múltiples productos RCA ("RCA multiprimado").
- Detección de amplificación producto y visualización, que se realiza más comúnmente a través de la detección fluorescente, con dNTP fluoróforo conjugados, fluoróforo complementario -tethered o etiquetados fluorescentemente balizas moleculares . Además de los enfoques fluorescentes, la electroforesis en gel también se usa ampliamente para la detección de productos RCA.
RCA produce una amplificación lineal de ADN, ya que cada plantilla circular crece a una velocidad determinada durante un cierto período de tiempo. Para aumentar el rendimiento y lograr una amplificación exponencial como lo hace la PCR, se han investigado varios enfoques. Uno de ellos es la amplificación de círculo rodante hiperramificado o HRCA, donde se agregan y también se extienden los cebadores que se aparean con los productos RCA originales. [12] De esta manera, el RCA original crea más plantilla que se puede amplificar. Otro es la amplificación de círculo a círculo o C2CA, donde los productos de RCA se digieren con una enzima de restricción y se ligan en nuevos moldes circulares usando un oligo de restricción, seguido de una nueva ronda de RCA con una mayor cantidad de moldes circulares para amplificación. [13]
Aplicaciones de RCA
El RCA puede amplificar un solo evento de unión molecular más de mil veces, lo que lo hace particularmente útil para detectar objetivos con abundancia ultrabaja. Las reacciones de RCA se pueden realizar no solo en entornos de solución libre, sino también en una superficie sólida como vidrio, micro o nanoperlas, placas de micropocillos, dispositivos de microfluidos o incluso tiras de papel. Esta característica la convierte en una herramienta muy poderosa para amplificar señales en inmunoensayos en fase sólida (por ejemplo, ELISA ). De esta manera, RCA se está convirtiendo en una herramienta de amplificación de señales altamente versátil con una amplia gama de aplicaciones en genómica, proteómica, diagnóstico y biosensores.
Inmuno-RCA
Immuno-RCA es un método de amplificación de señal isotérmica para la detección y cuantificación de proteínas de alta especificidad y alta sensibilidad. Esta técnica combina dos campos: RCA, que permite la amplificación de nucleótidos, e inmunoensayo, que utiliza anticuerpos específicos para biomarcadores intracelulares o libres. Como resultado, el inmuno-RCA da una señal amplificada específica (alta relación señal / ruido), lo que lo hace adecuado para detectar, cuantificar y visualizar marcadores proteicos de baja abundancia en inmunoensayos en fase líquida [14] [15] e inmunohistoquímica .
Immuno-RCA sigue una reacción inmunoabsorbente típica en ELISA o tinción de tejido inmunohistoquímica. [16] Los anticuerpos de detección utilizados en la reacción de inmuno-RCA se modifican uniendo un oligonucleótido de ssDNA al final de las cadenas pesadas. Por lo tanto, la sección Fab (fragmento, unión a antígeno) del anticuerpo de detección aún puede unirse a antígenos específicos y el oligonucleótido puede servir como cebador de la reacción de RCA.
El procedimiento típico de inmuno-RCA mediado por anticuerpos es el siguiente:
1. Un anticuerpo de detección reconoce una diana proteica específica. Este anticuerpo también está unido a un cebador oligonucleotídico.
2. Cuando hay ADN circular, se hibrida y el cebador coincide con la secuencia complementaria de ADN circular.
3. La secuencia complementaria de la plantilla circular de ADN se copia cientos de veces y permanece unida al anticuerpo.
4. La salida de RCA (ssDNA alargado) se detecta con sondas fluorescentes usando un microscopio fluorescente o un lector de microplacas.
Inmuno -RCA basado en aptámeros [17]
Además del inmuno-RCA mediado por anticuerpos, el cebador de ssDNA RCA también se puede conjugar con el extremo 3 'de un aptámero de ADN. La cola del cebador se puede amplificar mediante la amplificación del círculo rodante. El producto se puede visualizar mediante el etiquetado de reportero fluorescente. [18] El proceso se ilustra en la figura de la derecha.
Otras aplicaciones de RCA
Se utilizaron ampliamente varios derivados de RCA en el campo de la biodetección. Por ejemplo, el RCA se ha utilizado con éxito para detectar la existencia de ADN viral y bacteriano a partir de muestras clínicas, [19] [20] que es muy beneficioso para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas . También se ha utilizado como un método de amplificación de señal en chip para análisis de microarrays de ácido nucleico (tanto para ADN como para ARN) . [1]
Además de la función de amplificación en aplicaciones de biosensores, la técnica RCA se puede aplicar a la construcción de nanoestructuras de ADN e hidrogeles de ADN también. Los productos de RCA también se pueden utilizar como plantillas para el ensamblaje periódico de nanoespecies o proteínas, síntesis de nanocables metálicos [21] y formación de nano-islas. [1]
Ver también
- Técnica del selector
Referencias
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enlaces externos
- Sistemas de replicación de ADN utilizados con pequeñas moléculas circulares de ADN Genomes 2 , T. Brown et al., En NCBI Books
- Microbiología Bytes: Viroides y Virusoides
- http://mcmanuslab.ucsf.edu/node/246