La mutagénesis por saturación del sitio (SSM) , o simplemente la saturación del sitio , es una técnica de mutagénesis aleatoria utilizada en la ingeniería de proteínas , en la que un solo codón o conjunto de codones se sustituye por todos los posibles aminoácidos en la posición. [1] Hay muchas variantes de la técnica de saturación de sitios, desde la saturación de sitios emparejados (saturando dos posiciones en cada mutante de la biblioteca) hasta la saturación de sitios de exploración (realizando una saturación de sitios en cada sitio de la proteína, lo que da como resultado una biblioteca de tamaño [20 x (número de residuos en la proteína)] que contiene todos los posibles mutantes puntuales de la proteína).
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/f/f8/Site_saturation_mutagenesis.svg/220px-Site_saturation_mutagenesis.svg.png)
Método
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/b/b7/Site-directed_mutagenesis_library_cloning_steps.pdf/page1-440px-Site-directed_mutagenesis_library_cloning_steps.pdf.jpg)
La mutagénesis de saturación se logra comúnmente mediante PCR de mutagénesis dirigida al sitio con un codón aleatorizado en los cebadores (p . Ej., SeSaM ) [2] o mediante síntesis de genes artificiales , con una mezcla de nucleótidos de síntesis utilizados en los codones que se aleatorizarán. [3]
Pueden usarse diferentes codones degenerados para codificar conjuntos de aminoácidos. [1] Debido a que algunos aminoácidos están codificados por más codones que otros, la proporción exacta de aminoácidos no puede ser igual. Además, es habitual utilizar codones degenerados que minimizan los codones de parada (que generalmente no se desean). En consecuencia, el 'NNN' completamente aleatorizado no es ideal, y se utilizan codones degenerados alternativos más restringidos. 'NNK' y 'NNS' tienen la ventaja de codificar los 20 aminoácidos, pero aún codifican un codón de terminación el 3% del tiempo. Los codones alternativos como 'NDT', 'DBK' evitan los codones de parada por completo y codifican un conjunto mínimo de aminoácidos que aún abarcan todos los tipos biofísicos principales (aniónicos, catiónicos, alifáticos hidrofóbicos, aromáticos hidrofóbicos, hidrofílicos, pequeños). [1] En el caso de que no exista ninguna restricción para utilizar un único codón degenerado, es posible reducir considerablemente el sesgo. [4] [5] Se desarrollaron varias herramientas computacionales para permitir un alto nivel de control sobre los codones degenerados y sus correspondientes aminoácidos. [6] [7] [8]
Codón degenerado | No. de codones | No. de aminoácidos | No. de paradas | Aminoácidos codificados |
---|---|---|---|---|
NNN | 64 | 20 | 3 | Los 20 |
NNK / NNS | 32 | 20 | 1 | Los 20 |
NDT | 12 | 12 | 0 | RNDCGHILFSYV |
DBK | 18 | 12 | 0 | ARCGILMFSTWV |
NRT | 8 | 8 | 0 | RNDCGHSY |
Aplicaciones
La mutagénesis por saturación se usa comúnmente para generar variantes para la evolución dirigida . [9] [10]
Ver también
Referencias
- ^ a b c Reetz, MT; Carballeira JD (2007). "Mutagénesis de saturación iterativa (ISM) para la evolución rápida dirigida de enzimas funcionales". Protocolos de la naturaleza . 2 (4): 891–903. doi : 10.1038 / nprot.2007.72 . PMID 17446890 .
- ^ Zheng, Lei; Baumann, Ulrich; Reymond, Jean-Louis (15 de julio de 2004). "Un protocolo eficaz de mutagénesis de saturación de sitio y dirigido al sitio de un solo paso" . Investigación de ácidos nucleicos . 32 (14): e115. doi : 10.1093 / nar / gnh110 . ISSN 0305-1048 . PMC 514394 . PMID 15304544 .
- ^ Reetz, Manfred T .; Prasad, Shreenath; Carballeira, José D .; Gumulya, Yosephine; Bocola, Marco (7 de julio de 2010). "La mutagénesis de saturación iterativa acelera la evolución de laboratorio de la estereoselectividad enzimática: comparación rigurosa con los métodos tradicionales". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 132 (26): 9144–9152. doi : 10.1021 / ja1030479 . ISSN 0002-7863 . PMID 20536132 .
- ^ Kille, Sabrina; Acevedo-Rocha, Carlos G .; Parra, Loreto P .; Zhang, Zhi-Gang; Opperman, Diederik J .; Reetz, Manfred T .; Acevedo, Juan Pablo (15 de febrero de 2013). "Reducción de la redundancia de codones y el esfuerzo de detección de bibliotecas de proteínas combinatorias creadas por mutagénesis de saturación". Biología sintética ACS . 2 (2): 83–92. doi : 10.1021 / sb300037w . PMID 23656371 .
- ^ Tang, Lixia; Wang, Xiong; Ru, Beibei; Sun, Hengfei; Huang, Jian; Gao, Hui (junio de 2014). "MDC-Analyzer: una nueva herramienta de diseño de cebadores degenerados para la construcción de bibliotecas inteligentes de mutagénesis con sitios contiguos" . BioTechniques . 56 (6): 301-302, 304, 306-308, passim. doi : 10.2144 / 000114177 . ISSN 1940-9818 . PMID 24924390 .
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