Mutagénesis de saturación de secuencia
La mutagénesis por saturación de secuencia ( SeSaM ) es un método de mutagénesis aleatoria quimioenzimática aplicado para la evolución dirigida de proteínas y enzimas . [ cita requerida ] Es una de las técnicas de mutagénesis por saturación más comunes . En cuatro pasos de reacción basados en PCR , los nucleótidos de fosforotioato se insertan en la secuencia del gen , se escinden y los fragmentos resultantes se alargan mediante nucleótidos universales o degenerados.. Estos nucleótidos luego se reemplazan por nucleótidos estándar, lo que permite una amplia distribución de mutaciones de ácido nucleico repartidas en la secuencia del gen con preferencia a las transversiones y con un enfoque único en mutaciones puntuales consecutivas, ambas difíciles de generar mediante otras técnicas de mutagénesis. La técnica fue desarrollada por el profesor Ulrich Schwaneberg en la Universidad Jacobs de Bremen y la Universidad RWTH de Aquisgrán .
SeSaM se ha desarrollado para superar varias de las principales limitaciones encontradas al trabajar con métodos de mutagénesis estándar basados en técnicas simples de PCR propensas a errores (epPCR). Estas técnicas de epPCR se basan en el uso de polimerasas y, por lo tanto, encuentran limitaciones que se derivan principalmente de la circunstancia de que solo se realizan sustituciones de ácido nucleico [ cita requerida ] únicas, pero muy raramente consecutivas, y que estas sustituciones generalmente ocurren solo en posiciones específicas y favorecidas. Además, las transversiones de ácidos nucleicos son mucho menos probables que las transiciones y requieren polimerasas diseñadas específicamente con un sesgo alterado . [1]Estas características de los intercambios de ácidos nucleicos catalizados por epPCR, junto con el hecho de que el código genético está degenerado , reducen la diversidad resultante a nivel de aminoácidos . Las sustituciones sinónimas conducen a la conservación de aminoácidos o las mutaciones conservadoras con propiedades fisicoquímicas similares, como el tamaño y la hidrofobicidad, son muy frecuentes. [2] [3] Mediante la introducción no específica de bases universales en cada posición de la secuencia del gen, SeSaM supera el sesgo de la polimerasa que favorece las sustituciones transitorias en posiciones específicas, pero abre la secuencia del gen completa a una diversa gama de intercambios de aminoácidos. [4]
Durante el desarrollo del método SeSaM, se introdujeron varias modificaciones que permitieron la introducción de varias mutaciones simultáneamente. [5] Otro avance del método se logró mediante la introducción de bases degeneradas en lugar de la inosina universal y el uso de ADN polimerasas optimizadas, aumentando aún más la proporción de transversiones introducidas. [6] Este método SeSaM-TV+ modificado además permite y favorece la introducción de dos intercambios de nucleótidos consecutivos, ampliando fuertemente el espectro de aminoácidos que pueden ser sustituidos.
Mediante varias optimizaciones, incluida la aplicación de una quimera polimerasa mejorada en el Paso III del método SeSaM-TV-II[7] [8] y la adición de un nucleótido degenerado alternativo para la sustitución eficiente de las bases de timina y citosina y una mayor frecuencia de mutación en SeSaM -P/R, [9] las bibliotecas generadas se mejoraron aún más con respecto al número de transversión y el número de mutaciones consecutivas se elevó a 2–4 mutaciones consecutivas con una tasa de mutaciones consecutivas de hasta el 30 %. [10]
El método SeSaM consta de cuatro pasos basados en PCR que se pueden ejecutar en dos o tres días. Las partes principales incluyen la incorporación de nucleótidos de fosforotioato, la fragmentación química en estas posiciones, la introducción de bases universales o degeneradas y su reemplazo por nucleótidos naturales que insertan mutaciones puntuales.
Inicialmente, las secuencias universales "SeSaM" se insertan mediante PCR con cebadores específicos de genes que se unen delante y detrás del gen de interés. El gen de interés con sus regiones flanqueantes se amplifica para introducir estas secuencias SeSaM_fwd y SeSaM_rev y para generar una plantilla para pasos de PCR consecutivos.
