En la biología molecular , la mutagénesis es una técnica de laboratorio importante mediante el cual ADN mutaciones están deliberadamente por ingeniería genética para producir bibliotecas de genes mutantes, proteínas, cepas de bacterias u otros organismos modificados genéticamente. Los diversos constituyentes de un gen, así como sus elementos reguladores y sus productos génicos, pueden mutarse para poder examinar en detalle el funcionamiento de un locus, proceso o producto genético. La mutación puede producir proteínas mutantes con propiedades interesantes o funciones mejoradas o novedosas que pueden ser de uso comercial. También se pueden producir cepas mutantes que tengan una aplicación práctica o permitan investigar la base molecular de una función celular particular.
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Actualmente existen muchos métodos de mutagénesis. Inicialmente, el tipo de mutaciones inducidas artificialmente en el laboratorio eran completamente aleatorias utilizando mecanismos como la irradiación UV. La mutagénesis aleatoria no puede apuntar a regiones o secuencias específicas del genoma; sin embargo, con el desarrollo de mutagénesis dirigida al sitio , se pueden realizar cambios más específicos. Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR / Cas9, basada en un sistema de defensa viral procariota, ha permitido la edición o mutagénesis de un genoma in vivo . [1] La mutagénesis dirigida al sitio ha resultado útil en situaciones en las que la mutagénesis aleatoria no lo es. Otras técnicas de mutagénesis incluyen mutagénesis combinatoria e insercional. La mutagénesis que no es aleatoria se puede utilizar para clonar ADN, [2] investigar los efectos de mutágenos [3] y diseñar proteínas. [4] También tiene aplicaciones médicas como ayudar a pacientes inmunodeprimidos, investigación y tratamiento de enfermedades como el VIH y cánceres, y curar enfermedades como la beta talasemia . [5]
Mutagénesis aleatoria
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Los primeros enfoques de la mutagénesis se basaban en métodos que producían mutaciones completamente aleatorias. En tales métodos, las células u organismos se exponen a mutágenos tales como radiación UV o sustancias químicas mutagénicas, y luego se seleccionan mutantes con las características deseadas. Hermann Muller descubrió en 1927 que los rayos X pueden causar mutaciones genéticas en las moscas de la fruta , [6] y pasó a utilizar los mutantes que creó para sus estudios de genética . [7] En el caso de Escherichia coli , los mutantes pueden seleccionarse primero mediante exposición a radiación UV y luego colocarse en placas sobre un medio de agar. A continuación, las colonias formadas se replican en placas , una en un medio rico , otra en un medio mínimo, y los mutantes que tienen requisitos nutricionales específicos pueden identificarse por su incapacidad para crecer en el medio mínimo. Pueden repetirse procedimientos similares con otros tipos de células y con diferentes medios para la selección.
Posteriormente, se desarrollaron varios métodos para generar mutaciones aleatorias en proteínas específicas para detectar mutantes con propiedades interesantes o mejoradas. Estos métodos pueden implicar el uso de nucleótidos dopados en la síntesis de oligonucleótidos o la realización de una reacción de PCR en condiciones que mejoran la incorporación errónea de nucleótidos (PCR propensa a errores), por ejemplo, reduciendo la fidelidad de replicación o usando análogos de nucleótidos. [8] Una variación de este método para integrar mutaciones no sesgadas en un gen es la mutagénesis por saturación de secuencias . [9] Los productos de PCR que contienen mutación (es) se clonan luego en un vector de expresión y las proteínas mutantes producidas se pueden caracterizar.
En estudios con animales, los agentes alquilantes tales como N -etil- N nitrosourea (ENU) se han utilizado para generar ratones mutantes. [10] [11] El metanosulfonato de etilo (EMS) también se usa a menudo para generar mutantes de virus, plantas y animales. [12] [13] [14]
En una ley de la Unión Europea (como la directiva 2001/18), este tipo de mutagénesis puede usarse para producir OGM, pero los productos están exentos de la regulación: sin etiquetado, sin evaluación. [15]
Mutagénesis dirigida al sitio
Antes de las técnicas de mutagénesis dirigida al sitio de desarrollo, todas las mutaciones realizadas eran aleatorias y los científicos tenían que utilizar la selección del fenotipo deseado para encontrar la mutación deseada. Las técnicas de mutagénesis aleatoria tienen una ventaja en términos de cuántas mutaciones pueden producirse; sin embargo, aunque la mutagénesis aleatoria puede producir un cambio en un solo nucleótido, no ofrece mucho control sobre qué nucleótido se está cambiando. [5] Por lo tanto, muchos investigadores buscan introducir cambios seleccionados en el ADN de una manera precisa y específica del sitio. Los primeros intentos utilizan análogos de nucleótidos y otras sustancias químicas se utilizaron por primera vez para generar mutaciones puntuales localizadas . [16] Estos productos químicos incluyen aminopurina , que induce una transición de AT a GC , [17] mientras que la nitrosoguanidina, [18] bisulfito , [19] y N 4 -hidroxicitidina pueden inducir una transición de GC a AT. [20] [21] Estas técnicas permiten transformar mutaciones específicas en una proteína; sin embargo, no son flexibles con respecto a los tipos de mutantes generados, ni son tan específicos como los métodos posteriores de mutagénesis dirigida al sitio y, por lo tanto, tienen cierto grado de aleatoriedad. Con otras tecnologías, como la escisión del ADN en sitios específicos del cromosoma, la adición de nuevos nucleótidos y el intercambio de pares de bases, ahora es posible decidir dónde pueden ir las mutaciones. [11] [8]
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Las técnicas actuales para la mutación específica de sitio se originan a partir de la técnica de extensión de cebadores desarrollada en 1978. Tales técnicas comúnmente implican el uso de oligonucleótidos mutagénicos prefabricados en una reacción de extensión de cebadores con ADN polimerasa . Este método permite la mutación puntual o la deleción o inserción de pequeños tramos de ADN en sitios específicos. Los avances en la metodología han hecho que dicha mutagénesis sea ahora un proceso relativamente simple y eficiente. [3]
Se están desarrollando constantemente métodos más nuevos y eficientes de mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, una técnica llamada "extracto de clonación de ligación sin fisuras" (o SLiCE para abreviar) permite la clonación de ciertas secuencias de ADN dentro del genoma, y se puede insertar más de un fragmento de ADN en el genoma a la vez. [2]
La mutagénesis dirigida al sitio permite investigar el efecto de una mutación específica. Existen numerosos usos; por ejemplo, se ha utilizado para determinar qué tan susceptibles eran ciertas especies a los productos químicos que se utilizan con frecuencia en los laboratorios. El experimento utilizó mutagénesis dirigida al sitio para imitar las mutaciones esperadas de la sustancia química específica. La mutación resultó en un cambio en aminoácidos específicos y se analizaron los efectos de esta mutación. [3]
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El enfoque dirigido al sitio puede realizarse de forma sistemática en técnicas tales como mutagénesis de exploración de alanina , mediante la cual los residuos se mutan sistemáticamente a alanina para identificar residuos importantes para la estructura o función de una proteína. [22] Otro enfoque integral es la mutagénesis por saturación de sitios en la que un codón o un conjunto de codones pueden sustituirse por todos los aminoácidos posibles en las posiciones específicas. [23] [24]
Mutagénesis combinatoria
La mutagénesis combinatoria es una técnica de ingeniería de proteínas dirigida al sitio mediante la cual se pueden diseñar simultáneamente múltiples mutantes de una proteína basándose en el análisis de los efectos de mutaciones individuales aditivas. [25] Proporciona un método útil para evaluar el efecto combinatorio de un gran número de mutaciones en la función de las proteínas. [26] Se puede cribar un gran número de mutantes para una característica particular mediante análisis combinatorio. [25] En esta técnica, múltiples posiciones o secuencias cortas a lo largo de una cadena de ADN pueden modificarse exhaustivamente para obtener una biblioteca completa de proteínas mutantes. [25] La tasa de incidencia de variantes beneficiosas se puede mejorar mediante diferentes métodos para construir bibliotecas de mutagénesis. Un enfoque de esta técnica es extraer y reemplazar una parte de la secuencia de ADN con una biblioteca de secuencias que contiene todas las combinaciones posibles en el sitio de mutación deseado. El contenido del segmento insertado puede incluir secuencias de importancia estructural, propiedad inmunogénica o función enzimática. También se puede insertar un segmento al azar en el gen para evaluar la importancia estructural o funcional de una parte particular de una proteína. [25]
Mutagénesis insercional
La inserción de uno o más pares de bases, que resulta en mutaciones del ADN, también se conoce como mutagénesis por inserción. [27] Las mutaciones de ingeniería como estas pueden proporcionar información importante en la investigación del cáncer, como conocimientos mecánicos sobre el desarrollo de la enfermedad. Los retrovirus y transposones son las principales herramientas instrumentales en la mutagénesis de inserción. Se pueden utilizar retrovirus, como el virus del tumor de mamíferos del ratón y el virus de la leucemia murina, para identificar genes implicados en la carcinogénesis y comprender las vías biológicas de cánceres específicos. [28] Los transposones, segmentos cromosómicos que pueden someterse a transposición, se pueden diseñar y aplicar a la mutagénesis por inserción como un instrumento para el descubrimiento de genes del cáncer. [28] Estos segmentos cromosómicos permiten que la mutagénesis por inserción se aplique a prácticamente cualquier tejido de elección, al mismo tiempo que permite una profundidad más completa e imparcial en la secuenciación del ADN. [28]
Los investigadores han encontrado cuatro mecanismos de mutagénesis por inserción que pueden usarse en humanos. el primer mecanismo se llama inserción de potenciadores. Los potenciadores estimulan la transcripción de un gen en particular al interactuar con un promotor de ese gen. Este mecanismo en particular se utilizó por primera vez para ayudar a los pacientes gravemente inmunodeprimidos que necesito de médula ósea. A continuación, se insertaron en los pacientes gammaretrovirus portadores de potenciadores. El segundo mecanismo se denomina inserción de promotor. Los promotores proporcionan a nuestras células las secuencias específicas necesarias para comenzar la traducción. La inserción del promotor ha ayudado a los investigadores a aprender más sobre el virus del VIH. El tercer mecanismo es la inactivación genética. Un ejemplo de inactivación genética es el uso de mutagénesis por inserción para insertar un retrovirus que interrumpe el genoma de la célula T en pacientes con leucemia y les proporciona un antígeno específico llamado CAR que permite que las células T se dirijan a las células cancerosas. Los mecanismos finales se denominan sustitución del extremo 3 'del ARNm. Nuestros genes experimentan ocasionalmente mutaciones puntuales que causan talasemia beta que interrumpe la función de los glóbulos rojos. Para solucionar este problema, se introduce la secuencia genética correcta para los glóbulos rojos y se realiza una sustitución. [5]
Recombinación homóloga
La recombinación homóloga se puede utilizar para producir una mutación específica en un organismo. El vector que contiene una secuencia de ADN similar al gen que se va a modificar se introduce en la célula y, mediante un proceso de recombinación, reemplaza el gen diana en el cromosoma. Este método se puede utilizar para introducir una mutación o anular un gen, por ejemplo, como se utiliza en la producción de ratones inactivos . [29]
CRISPR
Desde 2013, el desarrollo de la tecnología CRISPR -Cas9 ha permitido la introducción eficiente de diferentes tipos de mutaciones en el genoma de una amplia variedad de organismos. El método no requiere un sitio de inserción de transposones, no deja marcadores y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición del genoma . [30] [31]
Síntesis de genes
A medida que disminuye el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN, la síntesis artificial de un gen completo es ahora un método viable para introducir mutaciones en un gen. Este método permite una mutación extensa en múltiples sitios, incluido el rediseño completo del uso de codones de un gen para optimizarlo para un organismo en particular. [32]
Ver también
- Ingeniería genética
- Oncomouse
- Mutagénesis saturada
- Evolución dirigida
Referencias
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