Ensayo de cambio térmico
Un ensayo de desplazamiento térmico ( TSA ) mide los cambios en la temperatura de desnaturalización térmica y, por lo tanto, la estabilidad de una proteína en condiciones variables, como variaciones en la concentración del fármaco, pH del tampón o fuerza iónica , potencial redox o mutación de secuencia . El método más común para medir los cambios térmicos de las proteínas es la fluorimetría de barrido diferencial ( DSF ) o termofluor , que utiliza tintes fluorogénicos especializados. [1]
La unión de ligandos de bajo peso molecular puede aumentar la estabilidad térmica de una proteína, como describen Daniel Koshland (1958) [2] y Kaj Ulrik Linderstrøm-Lang y Schellman (1959). [3] Casi la mitad de las enzimas requieren un cofactor de iones metálicos . [4] Las proteínas termoestables suelen ser más útiles que sus contrapartes no termoestables, por ejemplo, la ADN polimerasa en la reacción en cadena de la polimerasa, [5] por lo que la ingeniería de proteínas a menudo incluye la adición de mutaciones para aumentar la estabilidad térmica. La cristalización de proteínas es más exitosa para proteínas con un punto de fusión más alto [6].y la adición de componentes tampón que estabilizan las proteínas mejora la probabilidad de que se formen cristales de proteínas. [7] Si se examina el pH, se deben tener en cuenta los posibles efectos de la molécula tampón sobre la estabilidad térmica junto con el hecho de que el pKa de cada molécula tampón cambia de forma única con la temperatura. [8] Además, cada vez que se examina una especie cargada, se deben tener en cuenta los efectos del contraión .
La estabilidad térmica de las proteínas se ha investigado tradicionalmente mediante ensayos bioquímicos , dicroísmo circular o calorimetría diferencial de barrido . Los ensayos bioquímicos requieren una actividad catalítica de la proteína en cuestión, así como un ensayo específico. El dicroísmo circular y la calorimetría diferencial de barrido consumen grandes cantidades de proteína y son métodos de bajo rendimiento. El ensayo de termofluor fue el primer ensayo de desplazamiento térmico de alto rendimiento y su utilidad y limitaciones han estimulado la invención de una plétora de métodos alternativos. Cada método tiene sus fortalezas y debilidades, pero todos luchan con proteínas intrínsecamente desordenadas sin una estructura terciaria claramente definida. ya que la esencia de un ensayo de cambio térmico es medir la temperatura a la que una proteína pasa de una estructura bien definida a un desorden.
La técnica DSF-GTP fue desarrollada por un equipo dirigido por Patrick Schaeffer en la Universidad James Cook y publicada en Moreau et al. 2012. [9]El desarrollo de la fluorimetría diferencial de barrido y la capacidad de alto rendimiento del termofluor han facilitado enormemente el cribado de las condiciones de cristalización de proteínas y grandes bibliotecas mutantes en programas de genómica estructural, así como ligandos en programas de descubrimiento de fármacos y genómica funcional. Estas técnicas están limitadas por su requerimiento tanto de proteínas altamente purificadas como de colorantes solvatocrómicos, lo que genera la necesidad de tecnologías más robustas de alto rendimiento que puedan usarse con muestras de proteína cruda. Esta necesidad se satisfizo con el desarrollo de una nueva tecnología de alto rendimiento para la determinación cuantitativa de la estabilidad de las proteínas y la unión del ligando mediante fluorimetría diferencial de barrido de proteínas marcadas con proteína verde fluorescente.(GFP). Esta tecnología se basa en el principio de que un cambio en el entorno proximal de GFP, como el despliegue y la agregación de la proteína de interés, se puede medir a través de su efecto sobre la fluorescencia del fluoróforo. La tecnología es simple, rápida e insensible a las variaciones en los volúmenes de muestra, y la temperatura útil y el rango de pH son 30–80 ° C y 5–11 respectivamente. El sistema no requiere colorantes solvatocrómicos, lo que reduce el riesgo de interferencias. Las muestras de proteína simplemente se mezclan con las condiciones de prueba en una placa de 96 pocillos y se someten a un protocolo de curva de fusión utilizando un termociclador en tiempo real. Los datos se obtienen en 1 a 2 h e incluyen medidas de control de calidad únicas a través de la señal GFP. El DSF-GTP se ha aplicado para la caracterización de proteínas y el cribado de pequeños compuestos.[10] [11] [12] [13] [14]
