La microscopía de fuerza de tracción (TFM) es un método experimental para determinar las tracciones en la superficie de una célula biológica mediante la obtención de medidas del campo de desplazamiento circundante dentro de una matriz extracelular in vitro (ECM) .
Descripción general
Se sabe que el comportamiento mecánico dinámico de las interacciones célula-ECM y célula-célula influye en una amplia gama de funciones celulares, que incluyen necrosis, diferenciación , adhesión , migración , locomoción y crecimiento . TFM utiliza desplazamientos ECM observados experimentalmente para calcular la tracción , o vector de tensión, en la superficie de una celda. Antes de TFM, los esfuerzos observaron tracciones celulares en sustratos de caucho de silicona que se arrugaban alrededor de las células; [1] sin embargo, la cuantificación precisa de las tracciones en tal técnica es difícil debido al comportamiento no lineal e impredecible de las arrugas. Varios años más tarde, se introdujo la terminología TFM para describir un procedimiento computacional más avanzado que se creó para convertir las mediciones de la deformación del sustrato en tensiones de tracción estimadas. [2]
Metodología general
En el TFM convencional, los cultivos celulares se siembran sobre o dentro de un ECM 3D ópticamente transparente incrustado con microesferas fluorescentes (típicamente perlas de látex con diámetros que varían de 0,2 a 1 μm ). [3] [4] [5] [6] [7] Se puede utilizar una amplia gama de hidrogeles naturales y sintéticos para este propósito, con el requisito previo de que el comportamiento mecánico del material esté bien caracterizado y el hidrogel sea capaz de mantener viabilidad celular. Las células ejercerán sus propias fuerzas en este sustrato que, en consecuencia, desplazarán las perlas en el ECM circundante. En algunos estudios, se utiliza un detergente , enzima o fármaco para alterar el citoesqueleto , alterando así, o en ocasiones eliminando por completo, las tracciones generadas por la célula.
Primero, se calcula un campo de desplazamiento continuo a partir de un par de imágenes: la primera imagen es la configuración de referencia de microesferas que rodean una celda aislada, y la segunda imagen es la misma celda aislada rodeada por microesferas que ahora están desplazadas debido a la generación celular. tracciones. La microscopía de fluorescencia confocal se emplea generalmente para obtener imágenes de la superficie celular y las perlas fluorescentes. Después de calcular el campo de desplazamiento de traslación entre una configuración deformada y no deformada, se puede calcular un campo de deformación. A partir del campo de tensión, el campo de tensión que rodea la celda se puede calcular con el conocimiento del comportamiento tensión-deformación, o modelo constitutivo, del material de hidrogel circundante. Es posible avanzar un paso más y usar el campo de tensión para calcular las tracciones en la superficie de la celda, si los vectores normales a la superficie de la celda se pueden obtener a partir de una pila de imágenes en 3D . Aunque este procedimiento es una forma común de obtener las tracciones celulares del desplazamiento de las microesferas, algunos estudios han utilizado con éxito un algoritmo computacional inverso para producir el campo de tracción. [8] [9] [10]
Limitaciones
La resolución espacial del campo de tracción que se puede recuperar con TFM está limitada por el número de mediciones de desplazamiento por área. [11] El espaciamiento de las medidas de desplazamiento independientes varía con las configuraciones experimentales, pero generalmente es del orden de un micrómetro. Los patrones de tracción producidos por las células contienen con frecuencia máximos y mínimos locales que son más pequeños. La detección de estas finas variaciones en la tracción celular local con TFM sigue siendo un desafío.
Avances
En 2D TFM, las células se cultivan como una monocapa en la superficie de un sustrato delgado con una rigidez ajustable, y las microesferas cercanas a la superficie del sustrato sufren deformación a través de conexiones célula-ECM. Los cultivos de células 2.5D se hacen crecer de manera similar sobre una capa delgada de ECM, y las proteínas ECM estructurales diluidas se mezclan con el medio agregado por encima de las células y el sustrato. Aunque la mayor parte del trabajo fundamental en TFM se realizó en 2D o 2.5D, muchos tipos de células requieren las complejas señales biofísicas y bioquímicas de un ECM 3D para comportarse de una manera verdaderamente fisiológicamente realista en un entorno in vitro . [12]
Cuando la rotación o el estiramiento de un subvolumen es grande, se pueden introducir errores en el cálculo de las tracciones de la superficie celular, ya que la mayoría de las técnicas TFM emplean un marco computacional basado en la elasticidad lineal. Los avances recientes en TFM han demostrado que las células son capaces de ejercer deformaciones con magnitudes de deformación de hasta el 40%, lo que requiere el uso de un enfoque de teoría de deformación finita para tener en cuenta grandes magnitudes de deformación. [13]
Aplicaciones
Aunque TFM se usa con frecuencia para observar tracciones en la superficie de una celda individual espacialmente aislada, también se puede usar una variación de TFM para analizar el comportamiento colectivo de sistemas multicelulares. Por ejemplo, las velocidades de migración celular y la plitotaxis se observan junto con un mapa de variación de estrés calculado de una hoja de células monocapa, en un enfoque denominado microscopía de estrés monocapa. [14] El comportamiento mecánico de las células individuales frente a una capa confluente de células difiere en que la monocapa experimenta un estado de "tira y afloja". También hay evidencia de una redistribución de las tracciones que puede tener lugar antes que los cambios en la polaridad celular y la migración. [15]
TFM también ha demostrado ser particularmente útil para estudiar la durotaxis .
TFM se ha aplicado recientemente para explorar la mecánica de la invasión de células cancerosas con la hipótesis de que las células que generan grandes tracciones son más invasivas que las células con tracciones más bajas. [16] También se espera que los hallazgos recientes de TFM contribuyan al diseño de andamios óptimos para la ingeniería de tejidos y la regeneración del sistema nervioso periférico , [17] injertos arteriales , [18] y células epiteliales de la piel. [19]
Referencias
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