La dispersión de luz estática es una técnica en química física que mide la intensidad de la luz dispersa para obtener el peso molecular promedio M w de una macromolécula como un polímero o una proteína en solución. La medición de la intensidad de dispersión en muchos ángulos permite calcular el radio cuadrático medio, también llamado radio de giro R g . Mediante la medición de la intensidad de dispersión para muchas muestras de varias concentraciones, el segundo coeficiente virial A 2 , puede calcularse. [1] [2] [3] [4] [5]
La dispersión de luz estática también se utiliza comúnmente para determinar el tamaño de las suspensiones de partículas en los rangos sub-μm y supra-μm, a través de los formalismos de difracción de Lorenz-Mie (ver dispersión de Mie ) y Fraunhofer , respectivamente.
Para los experimentos de dispersión de luz estática, se lanza una luz monocromática de alta intensidad, generalmente un láser, en una solución que contiene las macromoléculas. Se utilizan uno o varios detectores para medir la intensidad de la dispersión en uno o varios ángulos. La dependencia angular es necesaria para obtener medidas precisas tanto de la masa molar como del tamaño de todas las macromoléculas de radio por encima del 1-2% de la longitud de onda incidente. Por lo tanto, las mediciones simultáneas en varios ángulos con respecto a la dirección de la luz incidente, conocidas como dispersión de luz de múltiples ángulos (MALS) o dispersión de luz láser de múltiples ángulos (MALLS), generalmente se consideran la implementación estándar de la dispersión de luz estática. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre la historia y la teoría de MALS en la dispersión de luz de múltiples ángulos .
Para medir el peso molecular promedio directamente sin calibración a partir de la intensidad de dispersión de la luz, es necesario conocer la intensidad del láser, la eficiencia cuántica del detector y el volumen de dispersión total y el ángulo sólido del detector. Dado que esto no es práctico, todos los instrumentos comerciales se calibran utilizando un dispersor fuerte y conocido como el tolueno, ya que la relación de Rayleigh de tolueno y algunos otros disolventes se midió utilizando un instrumento de dispersión de luz absoluta.
Teoría
Para un instrumento de dispersión de luz compuesto por muchos detectores colocados en varios ángulos, todos los detectores deben responder de la misma manera. Por lo general, los detectores tendrán una eficiencia cuántica ligeramente diferente , diferentes ganancias y observarán diferentes volúmenes de dispersión geométrica. En este caso es absolutamente necesaria una normalización de los detectores. Para normalizar los detectores, primero se realiza una medición de un disolvente puro. Luego se agrega un esparcidor isotrópico al solvente. Dado que los dispersores isotrópicos dispersan la misma intensidad en cualquier ángulo, la eficiencia y la ganancia del detector se pueden normalizar con este procedimiento. Es conveniente normalizar todos los detectores al detector de ángulo de 90 °.
donde I R (90) es la intensidad de dispersión medida para el dispersor de Rayleigh por el detector de ángulo de 90 °.
La ecuación más común para medir el peso molecular promedio en peso, M w , es la ecuación de Zimm [5] (el lado derecho de la ecuación de Zimm se proporciona incorrectamente en algunos textos, como lo señalaron Hiemenz y Lodge): [6]
dónde
y
con
y el vector de dispersión para la luz polarizada verticalmente es
con n 0 el índice de refracción del solvente, λ la longitud de onda de la fuente de luz, N A número de Avogadro (6.022x10 23 ), c la concentración de la solución, yd n / d c el cambio en el índice de refracción de la solución con el cambio en concentración. La intensidad del analito medida en ángulo es I A (θ) . En esta ecuación, el subíndice A es para el analito (la solución) y T es para el tolueno con la relación de Rayleigh de tolueno, siendo R T 1,35x10 −5 cm −1 para un láser de HeNe . Como se describió anteriormente, el radio de giro, R g , y el segundo coeficiente virial, A 2 , también se calculan a partir de esta ecuación. El incremento del índice de refracción dn / dc caracteriza el cambio del índice de refracción n con la concentración c , y puede medirse con un refractómetro diferencial.
Una gráfica de Zimm se construye a partir de una extrapolación doble a un ángulo cero y una concentración cero desde muchos ángulos y muchas mediciones de concentración. En la forma más simple, la ecuación de Zimm se reduce a:
para mediciones realizadas en ángulo bajo y dilución infinita ya que P (0) = 1 .
Por lo general, se desarrollan varios análisis para analizar la dispersión de partículas en solución para derivar las características físicas de las partículas mencionadas anteriormente. Un experimento simple de dispersión de luz estática implica que la intensidad promedio de la muestra que se corrige para la dispersión del solvente producirá la relación de Rayleigh , R en función del ángulo o del vector de onda q de la siguiente manera:
Análisis de datos
Parcela Guinier
La intensidad dispersa se puede trazar como una función del ángulo para dar información sobre la R g que se puede calcular simplemente usando la aproximación de Guinier de la siguiente manera:
donde ln (ΔR (θ)) = lnP (θ) también conocido como el factor de forma con q = 4πn 0 sin (θ / 2) / λ . Por lo tanto un gráfico de la corregido relación de Rayleigh , ? R (θ) vs pecado 2 (θ / 2) o q 2 producirá una pendiente R g 2 /3 . Sin embargo, esta aproximación solo es cierta para qR g <1 . Tenga en cuenta que para una gráfica de Guinier, el valor de dn / dc y la concentración no son necesarios.
Trama de Kratky
La gráfica de Kratky se usa típicamente para analizar la conformación de proteínas , pero se puede usar para analizar el modelo de caminata aleatoria de polímeros . Se puede hacer una gráfica de Kratky graficando sen 2 (θ / 2) ΔR (θ) vs sin (θ / 2) o q 2 ΔR (θ) vs q .
Parcela de Zimm
Para polímeros y complejos poliméricos de naturaleza monodispersa () según lo determinado por la dispersión de luz estática, un gráfico de Zimm es un medio convencional de derivar los parámetros tales como R g , masa molecular M w y el segundo coeficiente virial A 2 .
Se debe tener en cuenta que si no se implementa la constante de material K , una gráfica de Zimm solo producirá R g . Por lo tanto, la implementación de K producirá la siguiente ecuación:
Los experimentos se realizan en varios ángulos, que satisfacen la condición y al menos 4 concentraciones. La realización de un análisis Zimm en una sola concentración se conoce como análisis Zimm parcial y solo es válido para soluciones diluidas de dispersores de puntos fuertes . El Zimm parcial sin embargo, no produce el segundo coeficiente virial , debido a la ausencia de la concentración variable de la muestra. Más específicamente, se supone que el valor del segundo coeficiente virial es igual a cero o se ingresa como un valor conocido para realizar el análisis parcial de Zimm.
Dispersión múltiple
La dispersión de luz estática supone que cada fotón detectado solo se ha dispersado exactamente una vez. Por lo tanto, el análisis de acuerdo con los cálculos indicados anteriormente solo será correcto si la muestra se ha diluido lo suficiente para garantizar que los fotones no se dispersen varias veces por la muestra antes de ser detectados. La interpretación precisa se vuelve extremadamente difícil para los sistemas con contribuciones no despreciables de la dispersión múltiple. En muchos instrumentos comerciales en los que el análisis de la señal de dispersión se realiza automáticamente, es posible que el usuario nunca advierta el error. Particularmente para partículas más grandes y aquellas con alto índice de contraste de refracción, esto limita la aplicación de dispersión de luz estática estándar a concentraciones de partículas muy bajas. Por otro lado, para las macromoléculas solubles que exhiben un contraste de índice de refracción relativamente bajo frente al solvente, incluida la mayoría de los polímeros y biomoléculas en sus respectivos solventes, la dispersión múltiple rara vez es un factor limitante incluso a concentraciones que se acercan a los límites de solubilidad.
Sin embargo, como lo muestra Schaetzel, [7] es posible suprimir la dispersión múltiple en experimentos de dispersión de luz estática mediante un enfoque de correlación cruzada. La idea general es aislar la luz dispersa individualmente y suprimir las contribuciones no deseadas de la dispersión múltiple en un experimento de dispersión de luz estática. Se han desarrollado y aplicado diferentes implementaciones de la dispersión de luz por correlación cruzada. Actualmente, el esquema más utilizado es el denominado método de dispersión de luz dinámica 3D. [8] [9] El mismo método también se puede utilizar para corregir datos de dispersión de luz dinámica para múltiples contribuciones de dispersión. [10]
Dispersión de luz estática de gradiente de composición
Las muestras que cambian sus propiedades después de la dilución no pueden analizarse mediante la dispersión de luz estática en términos del modelo simple presentado aquí como la ecuación de Zimm. Un análisis más sofisticado conocido como 'dispersión de luz estática en gradiente de composición (o multiángulo)' (CG-SLS o CG-MALS) es una clase importante de métodos para investigar interacciones proteína-proteína , propiedades coligativas y otras interacciones macromoleculares, ya que proporciona, además del tamaño y el peso molecular, información sobre la afinidad y estequiometría de los complejos moleculares formados por una o más especies macromoleculares / biomoleculares asociadas. En particular, la dispersión de luz estática de una serie de diluciones puede analizarse para cuantificar la autoasociación, la oligomerización reversible y la atracción o repulsión no específica, mientras que la dispersión de luz estática de mezclas de especies puede analizarse para cuantificar la heteroasociación. [11]
Ver también
Referencias
- ^ A. Einstein (1910). "Theorie der Opaleszenz von homogenen Flüssigkeiten und Flüssigkeitsgemischen in der Nähe des kritischen Zustandes" . Annals of Physics . 33 (16): 1275. Bibcode : 1910AnP ... 338.1275E . doi : 10.1002 / yp.19103381612 .
- ^ CV Raman (1927). Indian J. Phys . 2 : 1. Falta o vacío
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( ayuda ) - ^ P. Debye (1944). "Dispersión de luz en soluciones". J. Appl. Phys . 15 (4): 338. Bibcode : 1944JAP .... 15..338D . doi : 10.1063 / 1.1707436 .
- ^ BH Zimm (1945). "Teoría molecular de la dispersión de la luz en fluidos". J. Chem. Phys . 13 (4): 141. Bibcode : 1945JChPh..13..141Z . doi : 10.1063 / 1.1724013 .
- ^ a b BH Zimm (1948). "La dispersión de la luz y la función de distribución radial de las soluciones de alto polímero". J. Chem. Phys . 16 (12): 1093. Código Bibliográfico : 1948JChPh..16.1093Z . doi : 10.1063 / 1.1746738 .
- ^ Hiemenz, Paul C .; Lodge, Timothy P. (2007). Química de polímeros (2ª ed.). Boca Raton, Fla. [Ua]: CRC Press. págs. 307-308. ISBN 978-1-57444-779-8.
- ^ Schaetzel, K. (1991). "Supresión de la dispersión múltiple mediante técnicas de correlación cruzada de fotones". J. Mod. Opt . 38 : SA393 – SA398. Código bibliográfico : 1990JPCM .... 2..393S . doi : 10.1088 / 0953-8984 / 2 / S / 062 .
- ^ Urban, C .; Schurtenberger, P. (1998). "Caracterización de suspensiones coloidales turbias mediante técnicas de dispersión de luz combinadas con métodos de correlación cruzada". J. Colloid Interface Sci . 207 (1): 150-158. Código Bibliográfico : 1998JCIS..207..150U . doi : 10.1006 / jcis.1998.5769 . PMID 9778402 .
- ^ Block, I .; Scheffold, F. (2010). "Dispersión de luz de correlación cruzada 3D modulada: Mejora de la caracterización de la muestra turbia". Revisión de instrumentos científicos . 81 (12): 123107–123107–7. arXiv : 1008.0615 . Código Bibliográfico : 2010RScI ... 81l3107B . doi : 10.1063 / 1.3518961 . PMID 21198014 . S2CID 9240166 .
- ^ Pusey, PN (1999). "Supresión de la dispersión múltiple mediante técnicas de correlación cruzada de fotones". Opinión actual en ciencia de interfases y coloides . 4 (3): 177–185. doi : 10.1016 / S1359-0294 (99) 00036-9 .
- ^ Algunos, D. (2013). "Análisis basado en la dispersión de luz de interacciones biomoleculares" . Biophys. Rev . 5 (2): 147-158. doi : 10.1007 / s12551-013-0107-1 . PMC 3641300 . PMID 23646069 .
enlaces externos
- Aplicación de la dispersión de luz estática.
- Litesizer