Existen muchos métodos para investigar las interacciones proteína-proteína que son los contactos físicos de alta especificidad establecidos entre dos o más moléculas de proteína que involucran fuerzas electrostáticas y efectos hidrofóbicos . Cada uno de los enfoques tiene sus propias fortalezas y debilidades, especialmente con respecto a la sensibilidad y especificidad del método. [1] Una sensibilidad alta significa que la pantalla detecta muchas de las interacciones que se producen. Una alta especificidad indica que la mayoría de las interacciones detectadas por la pantalla están ocurriendo en la realidad.
Métodos bioquímicos
Se considera que la co-inmunoprecipitación [ cita requerida ] es el ensayo estándar de oro para las interacciones proteína-proteína, especialmente cuando se realiza con proteínas endógenas (no sobreexpresadas ni etiquetadas ). La proteína de interés se aísla con un anticuerpo específico . Los compañeros de interacción que se adhieren a esta proteína se identifican posteriormente mediante transferencia Western . [2] Las interacciones detectadas por este enfoque se consideran reales. Sin embargo, este método solo puede verificar las interacciones entre los socios de interacción sospechosos. Por lo tanto, no es un enfoque de detección. Una nota de precaución también es que los experimentos de inmunoprecipitación revelan interacciones directas e indirectas. Por tanto, los resultados positivos pueden indicar que dos proteínas interactúan directamente o pueden interactuar a través de una o más moléculas puente. Esto podría incluir proteínas puente, ácidos nucleicos (ADN o ARN) u otras moléculas.
La complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es una nueva técnica para observar las interacciones de las proteínas. En combinación con otras técnicas nuevas, este método se puede utilizar para seleccionar interacciones proteína-proteína y sus moduladores, [3] DERB . [4]
Electroforesis de afinidad como se usa para la estimación de constantes de unión , como por ejemplo en electroforesis de afinidad de lectina o caracterización de moléculas con características específicas como contenido de glucanos o unión de ligandos .
Los ensayos pull-down son una variación común de inmunoprecipitación e inmunoelectroforesis y se usan de manera idéntica, aunque este enfoque es más adecuado para un cribado inicial de proteínas que interactúan.
La transferencia de etiquetas se puede utilizar para el cribado o la confirmación de interacciones de proteínas y puede proporcionar información sobre la interfaz donde tiene lugar la interacción. La transferencia de etiquetas también puede detectar interacciones débiles o transitorias que son difíciles de capturar utilizando otras estrategias de detección in vitro . En una reacción de transferencia de marcaje, una proteína conocida se marca con un marcador detectable. Luego, la etiqueta se pasa a una proteína que interactúa, que luego se puede identificar por la presencia de la etiqueta.
La visualización de fagos se utiliza para el cribado de alto rendimiento de interacciones de proteínas.
La reticulación in vivo de complejos proteicos utilizando análogos de aminoácidos fotorreactivos fue introducida en 2005 por investigadores del Instituto Max Planck [5]. En este método, las células se cultivan con análogos de diazirina fotorreactivos a leucina y metionina , que se incorporan a las proteínas. Tras la exposición a la luz ultravioleta, las diazirinas se activan y se unen a proteínas interactuantes que se encuentran a unos pocos angstroms del análogo de aminoácido fotorreactivo. [6]
El método de purificación por afinidad en tándem (TAP) permite una identificación de alto rendimiento de las interacciones de proteínas. En contraste con el enfoque de dos híbridos de levadura, la precisión del método puede compararse con la de los experimentos a pequeña escala [7] y las interacciones se detectan dentro del entorno celular correcto como por co-inmunoprecipitación . Sin embargo, el método de la etiqueta TAP requiere dos pasos sucesivos de purificación de proteínas y, en consecuencia, no puede detectar fácilmente interacciones transitorias entre proteínas. Krogan et al. y Gavin et al. proporcionando datos actualizados de interacción de proteínas para organismos de levadura. [8] [9]
La reticulación química se usa a menudo para "fijar" interacciones de proteínas en su lugar antes de intentar aislar / identificar proteínas que interactúan. Los reticulantes comunes para esta aplicación incluyen el reticulante éster de NHS no escindible , suberato de bisulfosuccinimidilo (BS3); una versión escindible de BS3, ditiobis (propionato de sulfosuccinimidilo) (DTSSP); y el imidoéster reticulante dimetil ditiobispropionimidato (DTBP) que es popular para fijar interacciones en ensayos de ChIP .
Reticulación química seguida de alta masa MALDI espectrometría de masas pueden usarse para analizar las interacciones proteína intacta en el lugar antes de intentar aislar / identificar proteínas que interactúan. Este método detecta interacciones entre proteínas no etiquetadas y está disponible en CovalX .
SPINE (experimento interacción Strepprotein) [10] utiliza una combinación de reticulación reversible con formaldehído y una incorporación de una etiqueta de afinidad para detectar parejas de interacción in vivo .
La inmunoprecipitación cuantitativa combinada con la eliminación (QUICK) se basa en la co-inmunoprecipitación, la espectrometría de masas cuantitativa ( SILAC ) y la interferencia de ARN (ARNi). Este método detecta interacciones entre proteínas endógenas no marcadas. [11] Por lo tanto, tiene la misma alta confianza que la co-inmunoprecipitación. Sin embargo, este método también depende de la disponibilidad de anticuerpos adecuados.
El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ es un método inmunohistoquímico que utiliza las denominadas sondas de PLA para la detección de proteínas, interacciones y modificaciones de proteínas. Cada sonda de PLA viene con una hebra de ADN corta única unida a ella y se une a anticuerpos primarios específicos de la especie o consta de anticuerpos primarios marcados directamente con ADN. [12] [13] Cuando las sondas de PLA están muy próximas, las cadenas de ADN pueden interactuar mediante la adición posterior de otros dos oligonucleótidos de ADN formadores de círculos. Después de la unión de los dos oligonucleótidos añadidos mediante ligación enzimática, se amplifican mediante amplificación de círculo rodante utilizando una polimerasa. Después de la reacción de amplificación, se ha producido una replicación de varios cientos de veces del círculo de ADN y las sondas oligonucleotídicas complementarias marcadas con fluoróforos o enzimas resaltan el producto. La alta concentración resultante de fluorescencia o señal cromogénica en cada producto de amplificación de una sola molécula es fácilmente visible como un punto brillante distinto cuando se observa con un microscopio de fluorescencia o un microscopio de campo claro estándar.
Métodos biofísicos y teóricos
La resonancia de plasmón de superficie (SPR) es la técnica sin etiquetas más común para la medición de interacciones biomoleculares. [ cita requerida ] Los instrumentos SPR miden el cambio en el índice de refracción de la luz reflejada desde una superficie metálica (el "biosensor"). La unión de biomoléculas al otro lado de esta superficie conduce a un cambio en el índice de refracción que es proporcional a la masa añadida a la superficie del sensor. En una aplicación típica, un socio de unión (el "ligando", a menudo una proteína) se inmoviliza en el biosensor y una solución con posibles socios de unión (el "analito") se canaliza sobre esta superficie. La acumulación de analito a lo largo del tiempo permite cuantificar las tasas de activación (kon), las tasas de desactivación (koff), las constantes de disociación (Kd) y, en algunas aplicaciones, las concentraciones activas del analito. [14] Varios proveedores diferentes ofrecen dispositivos basados en SPR. Los más conocidos son los instrumentos Biacore que fueron los primeros disponibles comercialmente.
La interferometría de polarización dual (DPI) se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína. DPI proporciona mediciones de alta resolución en tiempo real del tamaño molecular, la densidad y la masa. Si bien el marcado no es necesario, una de las especies de proteínas debe inmovilizarse en la superficie de una guía de ondas. Además de la cinética y la afinidad, también se pueden cuantificar los cambios conformacionales durante la interacción.
La dispersión de luz estática (SLS) mide los cambios en la dispersión de Rayleigh de los complejos de proteínas en solución y puede caracterizar interacciones débiles y fuertes sin marcar o inmovilizar las proteínas u otras biomacromoléculas. La medición de dispersión de luz estática de múltiples ángulos y gradiente de composición (CG-MALS) mezcla una serie de alícuotas de diferentes concentraciones o composiciones, mide el efecto de los cambios en la dispersión de luz como resultado de la interacción y ajusta la dispersión de luz correlacionada cambia con la concentración a una serie de modelos de asociación para encontrar el descriptor de mejor ajuste. Las interacciones débiles no específicas se caracterizan típicamente mediante el segundo coeficiente virial . Para la unión específica, este tipo de análisis puede determinar la estequiometría y la constante de asociación de equilibrio de uno o más complejos asociados, [15] incluyendo sistemas desafiantes como aquellos que exhiben homo- y heteroasociación simultánea, interacciones multivalentes y cooperatividad.
La dispersión de luz dinámica (DLS), también conocida como dispersión de luz cuasielástica (QELS), o espectroscopia de correlación de fotones, procesa las fluctuaciones dependientes del tiempo en la intensidad de la luz dispersa para producir el radio hidrodinámico de las partículas en solución. El radio hidrodinámico es el radio de una esfera sólida con el mismo coeficiente de difusión de traslación que el medido para la partícula de muestra. A medida que las proteínas se asocian, aumenta el radio hidrodinámico promedio de la solución. La aplicación del método de variación continua, también conocido como gráfico de trabajo , con el radio hidrodinámico de la solución como observable, permite la determinación in vitro de K d , estequiometría compleja, radio hidrodinámico complejo y Δ H ° y Δ S ° de la proteína. –Interacciones proteicas. [16] Esta técnica no implica inmovilización ni etiquetado. Se pueden caracterizar interacciones transitorias y débiles. En relación con la dispersión de luz estática, que se basa en la intensidad absoluta de la luz dispersa, el DLS es insensible a la luz de fondo de las paredes de las estructuras de contención. Esta insensibilidad permite mediciones de DLS a partir de volúmenes de 1 µL en placas de 1536 pocillos y reduce los requisitos de muestra al rango de femtomoles. Esta técnica también es adecuada para el cribado de componentes tampón y / o inhibidores / efectores de moléculas pequeñas.
El análisis de dispersión inducida por flujo (FIDA) es una nueva tecnología sin inmovilización y basada en capilares que se utiliza para la caracterización y cuantificación de la interacción biomolecular y la concentración de proteínas en condiciones nativas. [17] La técnica se basa en medir el cambio en el tamaño aparente (radio hidrodinámico) de un ligando selectivo cuando interactúa con el analito de interés. Un ensayo FIDA funciona en soluciones complejas (por ejemplo, plasma [18] ) y proporciona información sobre la concentración de analito, las constantes de afinidad, el tamaño molecular y la cinética de unión. Por lo general, un único ensayo se completa en minutos y solo requiere un consumo de muestra de unos pocos µl. [17]
La polarización / anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para medir las interacciones proteína-proteína o proteína-ligando. Normalmente, una pareja de unión se marca con una sonda de fluorescencia (aunque a veces se puede utilizar la fluorescencia de la proteína intrínseca del triptófano) y la muestra se excita con luz polarizada. El aumento de la polarización de la fluorescencia tras la unión de la proteína marcada a su pareja de unión puede usarse para calcular la afinidad de unión.
Con la espectroscopia de correlación de fluorescencia , una proteína se marca con un tinte fluorescente y la otra se deja sin marcar. Luego, las dos proteínas se mezclan y los datos generan la fracción de la proteína etiquetada que no está unida y unida a la otra proteína, lo que le permite obtener una medida de K D y afinidad de unión. También puede tomar medidas del curso del tiempo para caracterizar la cinética de unión. FCS también le dice el tamaño de los complejos formados para que pueda medir la estequiometría de la unión. Un método más poderoso es la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) que emplea técnicas de doble marcaje y correlación cruzada, lo que da como resultado relaciones señal-ruido muy mejoradas sobre FCS. Además, la excitación de dos y tres fotones prácticamente elimina los efectos de fotoblanqueo y proporciona una grabación ultrarrápida de datos FCCS o FCS.
La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica común cuando se observan las interacciones de diferentes proteínas. [19] [20] [21] [22] Aplicado in vivo, FRET se ha utilizado para detectar la ubicación y las interacciones de genes y estructuras celulares, incluidas las integrinas y las proteínas de membrana. [23] FRET se puede utilizar para obtener información sobre vías metabólicas o de señalización. [24] [25] [26]
La interferometría de biocapa (BLI) es una tecnología sin etiquetas para medir interacciones biomoleculares [27] [28] (proteína: proteína o proteína: molécula pequeña). Es una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada desde dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en la punta del biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas a la punta del biosensor provoca un cambio en el patrón de interferencia que se puede medir en tiempo real, proporcionando información detallada sobre la cinética de asociación y disociación de las dos moléculas, así como la constante de afinidad por la interacción de proteínas (k a , k d y K d ). Debido a la configuración del sensor, la técnica es muy adecuada tanto para muestras purificadas como crudas, así como para experimentos de cribado de alto rendimiento. El método de detección también se puede utilizar para determinar la concentración molar de analitos.
La determinación de proteínas actividad por RMN mediciones de relajación multi-nucleares, o espectroscopia de 2D-FT RMN en soluciones, combinado con el análisis de regresión no lineal de RMN relajación o 2D-FT espectroscopia de conjuntos de datos. Mientras que el concepto de actividad del agua es ampliamente conocido y utilizado en las biociencias aplicadas, su complemento, la actividad proteica que cuantifica las interacciones proteína-proteína, es mucho menos familiar para los biocientíficos ya que es más difícil de determinar en soluciones diluidas de proteínas; La actividad de las proteínas también es mucho más difícil de determinar para las soluciones de proteínas concentradas cuando la agregación de proteínas, no simplemente la asociación transitoria de proteínas, es a menudo el proceso dominante. [29]
La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se considera la técnica más cuantitativa disponible para medir las propiedades termodinámicas de las interacciones proteína-proteína y se está convirtiendo en una herramienta necesaria para los estudios estructurales del complejo proteína-proteína. Esta técnica se basa en la medición precisa de los cambios de calor que siguen a la interacción de las moléculas de proteína en solución, sin la necesidad de marcar o inmovilizar los socios de unión, ya que la absorción o producción de calor es una propiedad intrínseca de prácticamente todas las reacciones bioquímicas. ITC proporciona información sobre la estequiometría, entalpía, entropía y cinética de unión entre dos proteínas que interactúan. [30]
La termoforesis a microescala (MST), es un nuevo método que permite el análisis cuantitativo de interacciones moleculares en solución a escala de microlitros. La técnica se basa en la termoforesis de moléculas, que proporciona información sobre el tamaño de la molécula, la carga y la capa de hidratación. Dado que al menos uno de estos parámetros se ve afectado típicamente por la unión, el método puede usarse para el análisis de cada tipo de interacción o modificación biomolecular. El método funciona igualmente bien en tampones estándar y líquidos biológicos como sangre o lisado celular. Es un método de solución gratuito que no necesita inmovilizar a los socios vinculantes. MST proporciona información sobre la afinidad de unión, estequiometría, competición y entalpía de dos o más proteínas que interactúan. [31] [32]
El ensayo de unión de ligando basado en células rotativas que utiliza radiactividad o fluorescencia es un método reciente que mide las interacciones moleculares en células vivas en tiempo real. Este método permite la caracterización del mecanismo de unión, así como K d , k on y k off . Este principio se está aplicando en varios estudios, principalmente con ligandos de proteínas y células de mamíferos vivos. [33] [34] [35] [36]
La reflectometría de un solo color (SCORE) es una tecnología sin etiquetas para medir todo tipo de interacciones biomoleculares en tiempo real. Al igual que BLI, aprovecha los efectos de interferencia en capas delgadas. Sin embargo, no necesita una resolución espectral, sino que utiliza luz monocromática. Por lo tanto, es posible analizar no solo una única interacción, sino arreglos de alta densidad con hasta 10,000 interacciones por cm 2 . [37]
Métodos genéticos
La levadura de dos híbridos y bacteriana pantalla de dos híbridos [38] investigar la interacción entre proteínas de fusión artificiales. No requieren aislamiento de proteínas, sino que utilizan la transformación para expresar proteínas en bacterias o levaduras . Las células están diseñadas de manera que una interacción active la transcripción de un gen informador o una enzima informadora . [39]
Métodos computacionales
La mayoría de los métodos PPI requieren algún análisis de datos computacionales. Los métodos de esta sección son principalmente computacionales, aunque normalmente requieren datos generados por experimentos de laboratorio húmedo.
El acoplamiento proteína-proteína , la predicción de interacciones proteína-proteína basada únicamente en las estructuras proteicas tridimensionales de la difracción de rayos X de cristales de proteína, podría no ser satisfactoria. [40] [41]
El análisis de redes incluye el análisis de redes de interacción utilizando métodos de teoría de grafos o métodos estadísticos. El objetivo de estos estudios es comprender la naturaleza de las interacciones en el contexto de una célula o vía , no solo las interacciones individuales. [42]
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