3DISCO
3DISCO (siglas de "imágenes 3D de órganos aclarados con disolventes") [1] es un método histológico que hace que las muestras biológicas sean más transparentes (llamadas "aclaradas") mediante el uso de una serie de disolventes orgánicos para igualar el índice de refracción (IR) del tejido y medio circundante. Las estructuras en tejidos transparentes se pueden examinar mediante microscopía de fluorescencia sin necesidad de un seccionamiento físico que requiere mucho tiempo y una reconstrucción in silico posterior .
El método fue desarrollado por un equipo formado por Ali Ertürk y Hans-Ulrich Dodt del Instituto Max-Planck de Múnich [1] [2] principalmente para limpiar y obtener imágenes del cerebro y la médula espinal de ratones no seccionados. Posteriormente, el método o sus modificaciones se utilizaron con éxito en muchos campos de la investigación biológica para obtener imágenes e investigar todo el cuerpo del ratón, [3] la estructura y función del cerebro del ratón, [1] las células madre, [4] [5] los tejidos tumorales, [6] [7] [8] procesos de desarrollo [9] [10] o embriones humanos completos. [11]
El uso de solventes orgánicos para limpiar (hacer transparente) el tejido fue mencionado por primera vez hace más de un siglo por el anatomista alemán Werner Spalteholz . [12] [13] Pero con algunas excepciones [13] [14] (revisadas en [15] ) las técnicas de desbroce durante todo el siglo XX estaban casi olvidadas. Su renacimiento se produjo en la última década, probablemente gracias a la difusión de técnicas avanzadas de microscopía de fluorescencia que permiten el corte óptico de la muestra ( microscopía confocal , multifotónica o de lámina de luz ). [15] [16]
De las técnicas de limpieza actuales , el primer disolvente orgánico utilizado fue una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB). Los autores utilizaron esta solución para limpiar el cerebro del ratón, los embriones de ratón y todo el cuerpo de D. melanogaster . [17] El principal inconveniente de esta solución es el blanqueo de la señal de GFP y la limpieza insuficiente del tejido altamente mielinizado de animales adultos. [1] Por lo tanto, se probaron muchos otros reactivos con el objetivo de encontrar una limpieza más suficiente y compatible con GFP. Como resultado , se eligieron tetrahidrofurano (THF) y dibencil éter (DBE) como los mejores reactivos para la limpieza. [18]Basado en esos hallazgos, el protocolo 3DISCO se publicó en 2012. [1]
Las muestras biológicas (tejidos) son estructuras heterogéneas formadas por compuestos que difieren en sus índices de refracción. Por ejemplo, el agua tiene RI 1,33, los lípidos y las proteínas alrededor de 1,40 – 1,45. [19] Como resultado, la luz se dispersa en su camino a través del tejido, lo que conduce a una disminución de la resolución o incluso a la desaparición de la señal en muestras de más de unas pocas decenas de micrómetros. Una serie de pasos que incluyen la deshidratación y la eliminación de lípidos del tejido y su posterior incubación y obtención de imágenes en un medio con RI similar a las estructuras con imágenes, por lo tanto, disminuyen la dispersión de la luz y conducen a una muestra transparente. [20] [21]
Después de la fijación (normalmente con paraformaldehído ) y, finalmente, el marcado con colorantes, las muestras se deshidratan mediante incubación en soluciones con una concentración creciente (50 %, 70 %, 80 % y 100 % en agua) de tetrahidrofurano (THF). Debido a que carece de grupos reactivos de alcohol, aldehído o cetona, el THF es menos reactivo y conserva la fluorescencia mejor que otras soluciones deshidratantes. [21] [18] Después de la deshidratación, la muestra se enjuaga primero en diclorometano (DCM) y finalmente en éter dibencílico (DBE) para igualar el índice de refracción del tejido y el medio circundante, lo que da como resultado una muestra transparente. En DBE, las muestras también se almacenan y se obtienen imágenes. [1]
