La proteína verde fluorescente ( GFP ) es una proteína que exhibe una fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz en el rango de azul a ultravioleta . [2] [3] La etiqueta GFP se refiere tradicionalmente a la proteína aislada por primera vez de la medusa Aequorea victoria y, a veces, se la denomina avGFP . Sin embargo, se han encontrado GFP en otros organismos, incluidos corales , anémonas de mar , zoanítidos , copépodos y lancetas . [4]
La GFP de A. victoria tiene un pico de excitación mayor a una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisión está a 509 nm, que se encuentra en la parte verde inferior del espectro visible . El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de GFP es 0,79. La GFP del pensamiento marino ( Renilla reniformis ) tiene un único pico de excitación principal a 498 nm. GFP es una herramienta excelente en muchas formas de biología debido a su capacidad para formar un cromóforo interno sin requerir cofactores accesorios , productos génicos o enzimas / sustratos.que no sea oxígeno molecular. [5]
En biología celular y molecular , el gen GFP se utiliza con frecuencia como informador de expresión . [6] Se ha utilizado en formas modificadas para fabricar biosensores , y se han creado muchos animales que expresan GFP, lo que demuestra una prueba de concepto de que un gen puede expresarse en un organismo determinado, en órganos seleccionados o en células de interés. . La GFP puede introducirse en animales u otras especies mediante técnicas transgénicas y mantenerse en su genoma y en el de su descendencia. Hasta la fecha, la GFP se ha expresado en muchas especies, incluidas bacterias, levaduras, hongos, peces y mamíferos, incluso en células humanas. CientíficosRoger Y. Tsien , Osamu Shimomura y Martin Chalfie fueron galardonados con el Premio Nobel de Química 2008 el 10 de octubre de 2008 por su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente.
La mayoría de los genes disponibles comercialmente para GFP y proteínas fluorescentes similares tienen una longitud de alrededor de 730 pares de bases. La proteína natural tiene 238 aminoácidos. Su masa molecular es de 27 kD. [7] Por lo tanto, fusionar el gen GFP con el gen de una proteína de interés puede aumentar significativamente el tamaño y la masa molecular de la proteína, y puede afectar la función natural de la proteína o cambiar su ubicación o trayectoria de transporte dentro de la célula. [8]
En las décadas de 1960 y 1970, la GFP, junto con la proteína luminiscente separada aequorina (una enzima que cataliza la descomposición de la luciferina , liberando luz), se purificó por primera vez a partir de la medusa Aequorea victoria y sus propiedades fueron estudiadas por Osamu Shimomura . [9] En A. victoria , la fluorescencia de GFP se produce cuando la aequorina interactúa con los iones Ca 2+ , induciendo un resplandor azul. Parte de esta energía luminiscente se transfiere a la GFP, cambiando el color general hacia el verde. [10] Sin embargo, su utilidad como herramienta para los biólogos moleculares no comenzó a darse cuenta hasta 1992 cuandoDouglas Prasher informó la clonación y la secuencia de nucleótidos de wtGFP en Gene . [11] La financiación para este proyecto se había agotado, por lo que Prasher envió muestras de ADNc a varios laboratorios. El laboratorio de Martin Chalfie expresó la secuencia de codificación de wtGFP, con los primeros aminoácidos eliminados, en células heterólogas de E. coli y C. elegans , publicando los resultados en Science en 1994. [12] El laboratorio de Frederick Tsuji informó de forma independiente la expresión de la proteína recombinante un mes después. [13] Sorprendentemente, la molécula de GFP se plegó y fue fluorescente a temperatura ambiente, sin la necesidad de cofactores exógenos específicos de las medusas. Aunque este casi wtGFP era fluorescente, tenía varios inconvenientes, incluidos los espectros de excitación de pico doble, la sensibilidad al pH, la sensibilidad al cloruro, el rendimiento cuántico de fluorescencia deficiente, la fotoestabilidad deficiente y el plegamiento deficiente a 37 ° C.