ATAC-seq ( A ssay para T ransposase- A ccessible C hromatin usando SEC uir) es una técnica utilizada en biología molecular para evaluar el genoma de toda la accesibilidad de la cromatina . [1] En 2013, la técnica se describió por primera vez como un método avanzado alternativo para MNase-seq , FAIRE-Seq y DNase-Seq . [1] ATAC-seq es un análisis más rápido y sensible del epigenoma que DNase-seq o MNase-seq. [2] [3] [4]
Descripción
ATAC-seq identifica regiones de ADN accesibles sondeando cromatina abierta con transposasa Tn5 mutante hiperactiva que inserta adaptadores de secuenciación en regiones abiertas del genoma. [2] [5] Mientras que las transposasas naturales tienen un bajo nivel de actividad, ATAC-seq emplea la transposasa hiperactiva mutada. [6] En un proceso llamado "etiquetado", la transposasa Tn5 escinde y etiqueta el ADN de doble hebra con adaptadores de secuenciación. [7] [8] Los fragmentos de ADN etiquetados se purifican, amplifican mediante PCR y se secuencian mediante secuenciación de próxima generación . [8] Las lecturas de secuenciación se pueden usar para inferir regiones de mayor accesibilidad, así como para mapear regiones de sitios de unión de factores de transcripción y posiciones de nucleosomas. [2] El número de lecturas de una región se correlaciona con la apertura de la cromatina, a una resolución de un solo nucleótido. [2] ATAC-seq no requiere tratamiento con ultrasonidos ni extracción con fenol-cloroformo como FAIRE-seq; [9] sin anticuerpos como ChIP-seq; [10] y sin digestión enzimática sensible como MNase-seq o DNase-seq. [11] La preparación de ATAC-seq se puede completar en menos de tres horas. [12]
Aplicaciones
El análisis ATAC-Seq se utiliza para investigar una serie de firmas de accesibilidad a la cromatina. El uso más común son los experimentos de mapeo de nucleosomas , [3] pero se puede aplicar para mapear sitios de unión de factores de transcripción , [13] adaptado para mapear sitios de metilación del ADN , [14] o combinado con técnicas de secuenciación. [15]
La utilidad del mapeo de potenciadores de alta resolución abarca desde estudiar la divergencia evolutiva del uso de potenciadores (por ejemplo, entre chimpancés y humanos) durante el desarrollo [16] y descubrir un mapa potenciador específico de linaje utilizado durante la diferenciación de células sanguíneas. [17]
ATAC-Seq también se ha aplicado para definir el panorama de accesibilidad a la cromatina en todo el genoma en cánceres humanos, [18] y revelar una disminución general de la accesibilidad a la cromatina en la degeneración macular . [19] Se pueden realizar métodos de huella computacional en ATAC-seq para encontrar sitios de unión específicos de células y factores de transcripción con actividad específica de células. [13]
ATAC-seq de celda única
Se han realizado modificaciones al protocolo ATAC-seq para adaptarse al análisis de una sola célula . Los microfluidos se pueden utilizar para separar núcleos individuales y realizar reacciones ATAC-seq individualmente. [12] Con este enfoque, las células individuales se capturan mediante un dispositivo de microfluidos o un sistema de deposición líquida antes de la etiqueta. [12] [20] Una técnica alternativa que no requiere aislamiento de una sola célula es la indexación celular combinatoria. [21] Esta técnica utiliza códigos de barras para medir la accesibilidad de la cromatina en miles de células individuales; puede generar perfiles epigenómicos de 10,000-100,000 células por experimento. [22] Pero la indexación celular combinatoria requiere equipo adicional diseñado a medida o una gran cantidad de Tn5 modificado personalizado. [23] Recientemente, se desarrolló un método de código de barras combinado llamado sci-CAR, que permite el perfil conjunto de la accesibilidad cromática y la expresión genética de células individuales. [24]
El análisis computacional de scATAC-seq se basa en la construcción de una matriz de recuento con el número de lecturas por regiones de cromatina abiertas. Las regiones de cromatina abiertas se pueden definir, por ejemplo, mediante la llamada de picos estándar de datos pseudo-masivos de ATAC-seq. Otros pasos incluyen la reducción de datos con PCA y la agrupación de células. [20] Las matrices scATAC-seq pueden ser extremadamente grandes (cientos de miles de regiones) y son extremadamente escasas, es decir, menos del 3% de las entradas son distintas de cero. [25] Por lo tanto, la imputación de la matriz de recuento es otro paso crucial. Al igual que con ATAC-seq en masa, scATAC-seq permite encontrar reguladores como factores de transcripción que controlan la expresión génica de las células. Esto se puede lograr observando el número de lecturas alrededor de motivos TF [26] o análisis de huellas. [25]
Referencias
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Fuente externa
- Sondas ATAC-seq en estado de cromatina abierta (figura)
- ATAC-seq: perfilado epigenómico rápido y sensible
- HINT-ATAC: Identificación de sitios de unión a factores de transcripción usando ATAC-seq