MNase-seq , abreviatura de m icrococcal n Ucle ase la digestión con profunda SEC uir, [1] [2] [3] es una biológica molecular técnica que se ha utilizado desde 2008 para medir nucleosoma ocupación en el genoma humano . [1] Sin embargo, el término 'MNase-seq' no había sido acuñado hasta que un año más tarde, en 2009. [2] En resumen, esta técnica se basa en el uso de la no específica endo - exonucleasa micrococcal nucleasa , una enzima derivada de la bacteria Staphylococcus aureus, para unir y escindir regiones de ADN no unidas a proteínas en la cromatina . El ADN unido a histonas u otras proteínas unidas a cromatina (por ejemplo, factores de transcripción ) puede permanecer sin digerir. Luego, el ADN sin cortar se purifica a partir de las proteínas y se secuencia a través de uno o más de los diversos métodos de secuenciación de próxima generación . [4]
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MNase-seq es una de las cuatro clases de métodos utilizados para evaluar el estado del epigenoma mediante el análisis de la accesibilidad a la cromatina. Las otras tres técnicas son DNase-seq , FAIRE-seq y ATAC-seq . [3] Mientras que MNase-seq se usa principalmente para secuenciar regiones de ADN unidas por histonas u otras proteínas unidas a cromatina, [1] las otras tres se usan comúnmente para: mapear sitios hipersensibles de desoxirribonucleasa I (DHS) , [5] secuenciar el ADN no unido por proteínas de cromatina, [6] o regiones de secuenciación de cromatina empaquetada libremente a través de la transposición de marcadores, [7] [8] respectivamente. [3]
Historia
La nucleasa microcócica (MNasa) se descubrió por primera vez en S. aureus en 1956, [9] la proteína cristalizó en 1966, [10] y se caracterizó en 1967. [11] La digestión de la cromatina con MNasa fue clave para los primeros estudios de la estructura de la cromatina; utilizado para determinar que cada unidad nucleosómica de cromatina estaba compuesta por aproximadamente 200 pb de ADN. [12] Esto, junto con el modelo de "cuentas en una cuerda" de Olins y Olins , [13] confirmó las ideas de Kornberg con respecto a la estructura básica de la cromatina. [14] Tras estudios adicionales, se descubrió que la MNasa no podía degradar el ADN unido a histonas de menos de ~ 140 pb y que la DNasa I y II podían degradar el ADN unido a tan solo 10 pb. [15] [16] Esta última instancia dilucidado que ~ 146bp de envoltura de ADN alrededor del núcleo de nucleosoma, [17] ~ 50 pb de ADN enlazador conectar cada nucleosoma, [18] y que el 10 continuas pares de bases de ADN estrechamente se une al núcleo de la nucleosoma en intervalos. [dieciséis]
Además de utilizarse para estudiar la estructura de la cromatina, la digestión de nucleasas microcócicas se ha utilizado en experimentos de secuenciación de oligonucleótidos desde su caracterización en 1967. [19] La digestión de MNasa también se utilizó en varios estudios para analizar secuencias libres de cromatina, como la levadura ( Saccharomyces cerevisiae ) ADN mitocondrial [20] así como ADN bacteriófago [21] [22] a través de su digestión preferencial de regiones ricas en adenina y timina . [23] A principios de la década de 1980, se utilizó la digestión de MNasa para determinar la fase nucleosomal y el ADN asociado para los cromosomas de SV40 maduro , [24] moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) , [25] levadura, [26] y monos, [27] entre otros. El primer estudio que utilizó esta digestión para estudiar la relevancia de la accesibilidad de la cromatina a la expresión génica en humanos fue en 1985. En este estudio, se utilizó la nucleasa para encontrar la asociación de ciertas secuencias oncogénicas con la cromatina y las proteínas nucleares. [28] Los estudios que utilizan la digestión de MNasa para determinar el posicionamiento del nucleosoma sin secuenciación o información de matriz continuaron hasta principios de la década de 2000. [29]
Con el advenimiento de la secuenciación del genoma completo a finales de la década de 1990 y principios de la de 2000, fue posible comparar secuencias de ADN purificado con los genomas eucariotas de S. cerevisiae, [30] Caenorhabditis elegans , [31] D. melanogaster, [32] Arabidopsis thaliana , [33] Mus musculus , [34] y Homo sapiens . [35] La digestión de MNasa se aplicó por primera vez a estudios de ocupación de nucleosomas de todo el genoma en S. cerevisiae [36] y C. elegans, [37] acompañada de análisis a través de microarrays para determinar qué regiones de ADN estaban enriquecidas con nucleosomas resistentes a MNasa. Los análisis de microarrays basados en MNasa se utilizaron a menudo a escalas de todo el genoma para levaduras [38] [39] y en regiones genómicas limitadas en humanos [40] [41] para determinar la posición del nucleosoma, que podría usarse como una inferencia para la inactivación transcripcional .
No fue hasta 2008, cuando se estaba desarrollando la secuenciación de la próxima generación, cuando la digestión de MNasa se combinó con la secuenciación de alto rendimiento, a saber, la secuenciación de Solexa / Illumina , para estudiar el posicionamiento nucleosómico a una escala de todo el genoma en humanos. [1] Un año después, finalmente se acuñaron los términos “MNase-Seq” y “MNase-ChIP”, para la digestión de nucleasas microcócicas con inmunoprecipitación de cromatina . [2] Desde su aplicación inicial en 2008, [1] MNase-seq se ha utilizado para secuenciar en profundidad el ADN asociado con la ocupación de nucleosomas y la epigenómica en eucariotas. [4] A partir de febrero de 2020, MNase-seq todavía se aplica a la accesibilidad del ensayo en cromatina. [42]
Descripción
La cromatina es dinámica y el posicionamiento de los nucleosomas en el ADN cambia a través de la actividad de varios factores de transcripción y complejos de remodelación , reflejando aproximadamente la actividad transcripcional en estos sitios. El ADN envuelto alrededor de los nucleosomas generalmente es inaccesible a los factores de transcripción. [43] Por lo tanto, MNase-seq puede usarse para determinar indirectamente qué regiones de ADN son transcripcionalmente inaccesibles al determinar directamente qué regiones están unidas a nucleosomas. [4]
En un experimento típico de MNasa-seq, los núcleos de células eucariotas se aíslan primero de un tejido de interés. Luego, MNase-seq usa la nucleasa microcócica endo-exonucleasa para unir y escindir las regiones no unidas a proteínas del ADN de la cromatina eucariótica, primero escindiendo y resecando una hebra, luego escindiendo también la hebra antiparalela. [2] La cromatina se puede reticular opcionalmente con formaldehído . [44] La MNasa requiere Ca 2+ como cofactor , típicamente con una concentración final de 1 mM. [4] [11] Si una región de ADN está unida por el núcleo del nucleosoma (es decir, histonas ) u otras proteínas unidas a la cromatina (por ejemplo, factores de transcripción), entonces la MNasa no puede unirse y escindir el ADN. Los nucleosomas o los complejos ADN-proteína se pueden purificar de la muestra y el ADN unido se puede purificar posteriormente mediante electroforesis en gel y extracción . El ADN purificado es típicamente ~ 150 pb, si se purifica a partir de nucleosomas, [1] o más corto, si proviene de otra proteína (por ejemplo, factores de transcripción). [45] Esto hace que la secuenciación de lectura corta y alto rendimiento sea ideal para MNase-seq, ya que las lecturas de estas tecnologías son muy precisas pero solo pueden cubrir un par de cientos de pares de bases continuos de longitud. [46] Una vez secuenciadas, las lecturas se pueden alinear con un genoma de referencia para determinar qué regiones de ADN están unidas por nucleosomas o proteínas de interés, con herramientas como Bowtie . [3] El posicionamiento de los nucleosomas aclarado, a través de MNase-seq, se puede utilizar para predecir la expresión genómica [47] y la regulación [48] en el momento de la digestión.
Técnicas extendidas
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Secuenciación MNase-ChIP / CUT & RUN
Recientemente, también se ha implementado MNase-seq para determinar dónde se unen los factores de transcripción al ADN. [49] [50] El clásico ChIP-seq muestra problemas con la calidad de la resolución, el rigor en el protocolo experimental y la fragmentación del ADN . [50] Clásico ChIP-seq normalmente utiliza sonicación para fragmentar la cromatina , que sesga las regiones heterocromáticas debido a la unión condensada y estrecha de las regiones de cromatina entre sí. [50] A diferencia de las histonas , los factores de transcripción solo se unen transitoriamente al ADN. Otros métodos, como la sonicación en ChIP-seq, que requieren el uso de mayores temperaturas y detergentes, pueden conducir a la pérdida del factor. La secuenciación CUT & RUN es una forma novedosa de inmunoprecipitación basada en MNasa . En resumen, usa una MNasa etiquetada con un anticuerpo para unirse específicamente a proteínas unidas al ADN que presentan el epítopo reconocido por ese anticuerpo. Luego, la digestión ocurre específicamente en las regiones que rodean ese factor de transcripción, lo que permite que este complejo se difunda fuera del núcleo y se obtenga sin tener que preocuparse por los antecedentes importantes ni las complicaciones de la sonicación. El uso de esta técnica no requiere altas temperaturas ni altas concentraciones de detergente. Además, la MNasa mejora la digestión de la cromatina debido a su actividad exonucleasa y endonucleasa. Las células se lisan en una solución SDS / Triton X-100 . Luego, se agrega el complejo MNasa-anticuerpo. Y finalmente, se puede aislar el complejo proteína-ADN, purificándose y secuenciando posteriormente el ADN . El extracto soluble resultante contiene un enriquecimiento de 25 veces en fragmentos de menos de 50 pb. Este mayor enriquecimiento da como resultado datos rentables de alta resolución. [50]
MNase-seq de celda única
La secuenciación de nucleasas microcócicas unicelulares (scMNase-seq) es una técnica novedosa que se utiliza para analizar el posicionamiento de los nucleosomas y para inferir la accesibilidad de la cromatina con el uso de una entrada de una sola célula. [51] En primer lugar, las células se clasifican en alícuotas individuales mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) . [51] A continuación, las células se lisan y se digieren con nucleasa microcócica. El ADN aislado se somete a amplificación por PCR y luego se aísla y analiza la secuencia deseada. [51] El uso de MNasa en ensayos unicelulares da como resultado una mayor detección de regiones como los sitios hipersensibles a la ADNasa I , así como los sitios de unión al factor de transcripción. [51]
Comparación con otros ensayos de accesibilidad a la cromatina
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MNase-seq es uno de los cuatro métodos principales ( DNase -seq , MNase-seq, FAIRE-seq y ATAC-seq ) para una determinación más directa de la accesibilidad a la cromatina y las consecuencias posteriores para la expresión génica . [52] Las cuatro técnicas se contrastan con ChIP-seq , que se basa en la inferencia de que ciertas marcas en las colas de histonas son indicativas de la activación o represión de genes, [53] no evalúan directamente la posición del nucleosoma, sino que son valiosas para la evaluación de histonas función enzimática modificadora. [3]
DNasa-seq
Al igual que con MNase-seq, [1] DNase-seq se desarrolló combinando una endonucleasa de ADN existente [5] con tecnología de secuenciación de próxima generación para analizar la accesibilidad de la cromatina. [54] Ambas técnicas se han utilizado en varios eucariotas para determinar la información sobre el posicionamiento de los nucleosomas en los organismos respectivos [3] y ambas se basan en el mismo principio de digestión del ADN abierto para aislar bandas de ADN de ~ 140 pb de los nucleosomas [1] [55] o bandas más cortas si se determina la información del factor de transcripción. [45] [55] Ambas técnicas se han optimizado recientemente para la secuenciación unicelular, lo que corrige una de las principales desventajas de ambas técnicas; ese es el requisito para una entrada de celda alta. [56] [51]
En concentraciones suficientes, la ADNasa I es capaz de digerir el ADN unido al nucleosoma hasta 10 pb, mientras que la nucleasa microcócica no puede. [16] Además, DNasa-seq se usa para identificar DHS, que son regiones de ADN que son hipersensibles al tratamiento con DNasa y que a menudo son indicativas de regiones reguladoras (por ejemplo, promotores o potenciadores ). [57] No se encuentra un efecto equivalente con MNase. Como resultado de esta distinción, la DNasa-seq se utiliza principalmente para identificar directamente las regiones reguladoras, mientras que la MNasa-seq se utiliza para identificar el factor de transcripción y la ocupación nucleosómica para inferir indirectamente los efectos sobre la expresión génica. [3]
FAIRE-seq
FAIRE-seq difiere más de MNase-seq que DNase-seq. [3] FAIRE-seq se desarrolló en 2007 [6] y se combinó con la secuenciación de próxima generación tres años después para estudiar las DHS. [58] FAIRE-seq se basa en el uso de formaldehído para reticular las proteínas diana con el ADN y luego la sonicación posterior y la extracción con fenol-cloroformo para separar el ADN no reticulado y el ADN reticulado. El ADN no reticulado se secuencia y analiza, lo que permite la observación directa de la cromatina abierta. [59]
MNase-seq no mide la accesibilidad a la cromatina tan directamente como FAIRE-seq. Sin embargo, a diferencia de FAIRE-seq, no necesariamente requiere reticulación, [4] ni depende de la sonicación, [3] pero puede requerir extracción con fenol y cloroformo . [4] Dos desventajas principales de FAIRE-seq, en relación con las otras tres clases, son la entrada mínima requerida de 100.000 células y la dependencia de la reticulación. [6] La reticulación puede unir otras proteínas unidas a la cromatina que interactúan transitoriamente con el ADN, limitando así la cantidad de ADN no reticulado que puede recuperarse y analizarse a partir de la fase acuosa. [52] Por lo tanto, la resolución general obtenida de FAIRE-seq puede ser relativamente menor que la de DNase-seq o MNase-seq [52] y con el requisito de 100.000 células, [6] los equivalentes de una sola célula de DNase-seq [ 56] o MNase-seq [51] las convierten en alternativas mucho más atractivas. [3]
ATAC-seq
ATAC-seq es la clase desarrollada más recientemente de ensayos de accesibilidad a la cromatina. [7] ATAC-seq utiliza una transposasa hiperactiva para insertar marcadores transponibles con adaptadores específicos, capaces de unir cebadores para secuenciar, en regiones abiertas de cromatina. Luego, la PCR se puede usar para amplificar secuencias adyacentes a los transposones insertados, lo que permite la determinación de secuencias de cromatina abiertas sin provocar un cambio en la estructura de la cromatina. [7] [8] Se ha demostrado que ATAC-seq es eficaz en humanos, entre otros eucariotas, incluso en muestras congeladas. [60] Al igual que con DNase-seq [56] y MNase-seq, [51] también se ha desarrollado una versión unicelular exitosa de ATAC-seq. [61]
ATAC-seq tiene varias ventajas sobre MNase-seq en la evaluación de la accesibilidad a la cromatina. ATAC-seq no se basa en la digestión variable de la nucleasa microcócica, ni en la reticulación o extracción con fenol-cloroformo. [4] [8] Generalmente mantiene la estructura de la cromatina, por lo que los resultados de ATAC-seq se pueden utilizar para evaluar directamente la accesibilidad a la cromatina, en lugar de hacerlo indirectamente a través de MNase-seq. ATAC-seq también se puede completar en unas pocas horas, [8] mientras que las otras tres técnicas generalmente requieren períodos de incubación durante la noche. [4] [5] [6] Las dos principales desventajas de ATAC-seq, en comparación con MNase-seq, son el requisito de una mayor cobertura de secuenciación y la prevalencia de contaminación mitocondrial debido a la inserción inespecífica de ADN en ambos ADN mitocondriales y ADN nuclear. [7] [8] A pesar de estas pequeñas desventajas, el uso de ATAC-seq sobre las alternativas es cada vez más frecuente. [3]
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