La extracción de fenol-cloroformo es una técnica de extracción líquido-líquido en biología molecular que se utiliza para separar los ácidos nucleicos de las proteínas y los lípidos . [1]
Proceso
Las muestras acuosas, las células lisadas o el tejido homogeneizado se mezclan con volúmenes iguales de una mezcla de fenol : cloroformo . A continuación, esta mezcla se centrifuga. Debido a que la mezcla de fenol : cloroformo es inmiscible con agua, la centrífuga hará que se formen dos fases distintas: una fase acuosa superior y una fase orgánica inferior. La fase acuosa sube a la cima porque es menos densa que la fase orgánica que contiene el fenol: cloroformo. Esta diferencia de densidad es la razón por la que el fenol, que solo tiene una densidad ligeramente más alta que el agua, debe mezclarse con cloroformo para formar una mezcla con una densidad mucho más alta que el agua.
Los lípidos hidrófobos se dividirán en la fase orgánica inferior y las proteínas permanecerán en la interfase entre las dos fases, mientras que los ácidos nucleicos (así como otros contaminantes como sales, azúcares, etc.) permanecerán en la fase acuosa superior. A continuación, se puede pipetear la fase acuosa superior. Se debe tener cuidado para evitar pipetear la fase orgánica o el material en la interfaz . Este procedimiento a menudo se realiza varias veces para aumentar la pureza del ADN. [2] Este procedimiento produce ADN bicatenario grande que se puede utilizar en PCR o RFLP .
Si la mezcla es ácida, el ADN se precipitará en la fase orgánica mientras que el ARN permanece en la fase acuosa. Esto se debe a que el ADN se neutraliza más fácilmente que el ARN.
Hay algunas desventajas de esta técnica en el uso forense. Consume mucho tiempo y utiliza reactivos peligrosos. Además, debido a que es un proceso de dos pasos que implica la transferencia de reactivos entre tubos, tiene un mayor riesgo de contaminación . [3]
Ver también
Referencias
- ^ Chan, PK S .; Chan, DP; Para, KF; Yu, MI; Cheung, JL; Cheng, AF (2001). "Evaluación de métodos de extracción de tejidos embebidos en cera de parafina para la amplificación por PCR de ADN humano y viral" . Revista de patología clínica . 54 (5): 401–403. doi : 10.1136 / jcp.54.5.401 . PMC 1731425 . PMID 11328843 .
- ^ Sambrook, Joseph; Russell, David W. (2001). "Técnicas de uso común en clonación molecular" . Clonación molecular . 3 .
- ^ Li, Richard (2015). Biología forense . Boca Ratón: CRC Press, Taylor & Francis Group. págs. 115-117. ISBN 9781439889701.