Los marcadores de afinidad son una clase de inhibidores de enzimas que se unen covalentemente a su objetivo provocando su inactivación. El sello distintivo de una etiqueta de afinidad es el uso de un resto de direccionamiento para entregar de manera específica y reversible un grupo débilmente reactivo a la enzima que se une irreversiblemente a un residuo de aminoácido. La porción de dirección del marcador a menudo se parece al sustrato natural de la enzima, de modo que se usa un modo similar de unión no covalente antes del enlace covalente. [1] [2] Su utilidad en medicina puede estar limitada por la especificidad del primer paso de unión no covalente, mientras que la acción indiscriminada se puede utilizar para fines como el etiquetado de afinidad.- una técnica para la validación de la unión de compuestos por sustrato específico. [1]
Estos marcadores no se limitan a enzimas, sino que también pueden diseñarse para reaccionar con anticuerpos o ribozimas, aunque este uso es menos común. Aunque las proteínas como la hemoglobina no tienen un sitio activo, las bolsas de unión pueden explotarse por su afinidad y, por lo tanto, marcarse.
Clasificaciones
Las etiquetas de afinidad se pueden dividir en tres categorías distintas según sus grupos reactivos y el modo de administración. [3]
Etiquetas de afinidad clásicas
Esta categoría abarca el enfoque más simple de acoplar un electrófilo con baja reactividad intrínseca a un resto de unión no covalente que frecuentemente imita el sustrato natural. La clave de esta designación es que la reactividad del electrófilo no se ve alterada por la enzima y que el resto de unión no covalente sirve para aumentar la presencia y la vida útil del electrófilo en el sitio activo ( molaridad efectiva ). El grupo débilmente reactivo puede reaccionar con grupos funcionales fuera del sitio activo o en otras proteínas, pero la selectividad la confiere el resto de unión no covalente. Las firmas cinéticas de este tipo de inhibidor se pueden encontrar en saturación debido a que la reacción covalente (kinact) se convierte en el paso limitante de la velocidad a altas concentraciones de inhibidor. Un puñado de medicamentos como el afatinib han obtenido la aprobación de la FDA a través de este enfoque. También se ha estudiado el enfoque inverso de usar un inhibidor débilmente nucleofílico para atacar a un electrófilo unido a proteínas. Este enfoque ha recibido mucha menos atención debido a la falta de electrófilos de proteínas y solo se puede apuntar a aquellos con cofactores adecuados . [1] [3]
Etiquetas de afinidad en reposo
Los marcadores de afinidad en reposo representan un enfoque prometedor para inhibir enzimas utilizando funcionalidades reactivas "enmascaradas" que solo se descubren dentro del sitio activo. Este enfoque se diferencia de los inactivadores basados en mecanismos en que la catálisis debe estar "fuera de ruta". Uno de los mejores ejemplos para explicar esta forma de catálisis es la inactivación de dimetilargina dimetilaminohidrolasa (DDAH) por 4-halopiridinas. A pH fisiológico, el grupo 4-halo tiene una reactividad casi insignificante con los tiolatos, pero tras la protonación del nitrógeno, la reactividad aumenta ~ 4500 veces. Esta protonación ocurre fuera de la ruta por un residuo de aspartato que normalmente no está involucrado en la catálisis. Tras el ataque de la cisteína del sitio activo y la pérdida del haluro, la enzima se modifica irreversiblemente. Este requisito de catálisis sintoniza la selectividad de la modificación. [3] Esta clase no se limita a las halopiridinas y se han utilizado grupos funcionales que incluyen epóxidos y peptidil aciloximetil cetonas. La firma cinética de esta clase se parece a la de las etiquetas de afinidad clásicas. Este término se ha utilizado previamente para describir marcadores de afinidad que contienen grupos débilmente reactivos, pero la bibliografía reciente ha comenzado sobre el requisito de catálisis fuera de ruta. [4]
Etiquetas de fotoafinidad
Los marcadores de fotoafinidad se caracterizan por la reactividad no enzimática producida por la exposición a la luz y un resto de direccionamiento no covalente para mejorar la molaridad efectiva de este grupo reactivo en el sitio activo. Si bien esta técnica parece sólida en teoría, con frecuencia se observa un bajo grado de marcaje debido principalmente a la extinción de las especies reactivas por el disolvente u otras especies en solución. Sin embargo, esta extinción puede ser ventajosa ya que es un proceso tan rápido que una vez que se forma la especie reactiva, no se difundirá en ningún grado apreciable y solo reaccionará con moléculas a las que se encuentre inmediatamente adyacente.
Los marcadores de fotoafinidad no son muy prometedores para la inhibición o en el uso de fármacos, pero son adecuados para identificar sitios de unión de ligandos. A menudo se emplean grupos reactivos tales como nitrenos o 2-aril-5-carboxitetrazoles para generar carbenos no selectivos altamente reactivos o intermedios nitrilo-imina moderadamente selectivos, respectivamente. [2] [3]
Usos del etiquetado de afinidad
Al caracterizar una enzima, es fundamental identificar los residuos de aminoácidos responsables de la catálisis. Si bien está claro que la cristalografía de rayos X proporcionará información tridimensional más detallada sobre el sitio activo, solo se devuelve una imagen estática y se pueden encontrar dificultades con la cocristalización del sustrato o imitaciones debido al recambio enzimático.
El ejemplo clásico del uso de etiquetas de afinidad para este propósito es el mapeo de la topografía del sitio activo de quimotripsina. Mediante el uso de tres marcadores de afinidad diferentes que colocaron grupos reactivos (halometilcetonas o fosfofluoruros) en diferentes regiones del núcleo del sustrato natural, se pudieron determinar las posiciones relativas y la identidad de tres aminoácidos diferentes. [1] Otro ejemplo notable del uso del etiquetado de afinidad para determinar el sitio activo de una enzima es el trabajo realizado por Grachev et al. lo que resultó en la caracterización de la subunidad β de la ARN polimerasa del núcleo como la subunidad responsable de la formación de enlaces fosfodiéster en el proceso de transcripción procariota. [5]
Perfilado de proteínas basado en la actividad (ABPP)
La unidad básica de la proteómica basada en la actividad es la sonda, que normalmente consta de dos elementos: un grupo reactivo (RG, a veces llamado "ojiva") y una etiqueta. Además, algunas sondas pueden contener un grupo de unión que mejora la selectividad. El grupo reactivo generalmente contiene un electrófilo especialmente diseñado que se une covalentemente a un residuo nucleófilo en el sitio activo de una enzima activa. Una enzima inhibida o modificada postraduccionalmente no reaccionará con una sonda basada en actividad. La etiqueta puede ser un indicador como un fluoróforo o una etiqueta de afinidad como biotina o un alquino o azida para su uso con la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen (también conocida como química de clic).
Ver también
Referencias
- ↑ a b c d Wofsy L, Metzger H, Singer SJ (noviembre de 1962). "Marcado de afinidad: un método general para marcar los sitios activos de moléculas de anticuerpos y enzimas". Bioquímica . 1 : 1031–9. doi : 10.1021 / bi00912a013 . PMID 14001461 .
- ^ a b Colman RF (1995). "Etiquetado de afinidad y enfoques relacionados para apuntar a sitios enzimáticos específicos". En Biswas BB, Roy S (eds.). Proteínas: estructura, función e ingeniería . Bioquímica subcelular. 24 . Boston, MA: Springer. págs. 177–205. doi : 10.1007 / 978-1-4899-1727-0_7 . ISBN 978-1-4899-1729-4.
- ^ a b c d Tuley A, Fast W (junio de 2018). "La taxonomía de inhibidores covalentes" . Bioquímica . 57 (24): 3326–3337. doi : 10.1021 / acs.biochem.8b00315 . PMC 6016374 . PMID 29689165 .
- ^ Johnson CM, Linsky TW, Yoon DW, Person MD, Fast W (febrero de 2011). "Descubrimiento de halopiridinas como etiquetas de afinidad en reposo: inactivación de dimetilaminohidrolasa de dimetilarginina" . Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 133 (5): 1553–62. doi : 10.1021 / ja109207m . PMC 3038607 . PMID 21222447 .
- ^ Grachev, MA, TI Kolocheva, EA Lukhtanov y AA Mustaev. 1987. Estudios sobre la topografía funcional de la ARN polimerasa de Escherichia coli. Marcado de afinidad altamente selectivo por análogos de sustratos iniciadores. EUR. J. Biochem. 163: 113-121. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1987.tb10743.x