ADN tumoral circulante
El ADN tumoral circulante (ctDNA) es ADN fragmentado derivado de un tumor en el torrente sanguíneo que no está asociado con las células. El ctDNA no debe confundirse con el ADN libre de células (cfDNA), un término más amplio que describe el ADN que circula libremente en el torrente sanguíneo, pero que no es necesariamente de origen tumoral. Debido a que el ctDNA puede reflejar todo el genoma del tumor , ha ganado terreno por su potencial utilidad clínica; Se pueden tomar " biopsias líquidas " en forma de extracciones de sangre en varios momentos para monitorear la progresión del tumor a lo largo del régimen de tratamiento. [1]
El ctDNA se origina directamente del tumor o de las células tumorales circulantes (CTC), [2] que describe células tumorales viables e intactas que se desprenden de los tumores primarios y entran en el torrente sanguíneo o en el sistema linfático . El mecanismo preciso de liberación de ctDNA no está claro. Los procesos biológicos que se postula que están involucrados en la liberación de ctDNA incluyen la apoptosis y la necrosis de las células moribundas, o la liberación activa de las células tumorales viables. [3] [4] [5] [6] [7] Estudios en humanos (pacientes sanos y con cáncer) [8] y ratones xenoinjertados [9]muestran que el tamaño del cfDNA fragmentado es predominantemente de 166 pb de largo, lo que corresponde a la longitud del ADN envuelto alrededor de un nucleosoma más un conector. La fragmentación de esta longitud podría ser indicativa de fragmentación de ADN apoptótico , lo que sugiere que la apoptosis puede ser el método principal de liberación de ctDNA. La fragmentación de cfDNA está alterada en el plasma de pacientes con cáncer. [10] [11]
En el tejido sano, los fagocitos que se infiltran son responsables de la eliminación de restos celulares apoptóticos o necróticos, que incluyen el ADN sin células. [12] El ctDNA en pacientes sanos solo está presente en niveles bajos, pero se pueden detectar niveles más altos de ctDNA en pacientes con cáncer con tumores de mayor tamaño. [13] Esto posiblemente ocurre debido a la infiltración ineficiente de células inmunitarias en los sitios del tumor, lo que reduce la eliminación efectiva de ctDNA del torrente sanguíneo. [12] La comparación de mutaciones en ctDNA y ADN extraído de tumores primarios de los mismos pacientes reveló la presencia de cambios genéticos idénticos relacionados con el cáncer. [14] [15]Esto condujo a la posibilidad de utilizar ctDNA para la detección temprana del cáncer y el seguimiento del tratamiento. [dieciséis]
Cuando la sangre se recolecta en tubos con EDTA y se almacena, los glóbulos blancos comienzan a lisarse y liberan ADN genómico de tipo salvaje en la muestra en cantidades típicamente muchas veces superiores a las que contiene el ctADN. [17] Esto dificulta la detección de mutaciones u otros biomarcadores ctDNA más difíciles. [18] El uso de tubos de estabilización de células disponibles en el mercado puede prevenir o retrasar la lisis de los glóbulos blancos, reduciendo así el efecto de dilución del ctDNA. [19] Sherwood et al demostraron una detección superior de las mutaciones de KRAS en muestras emparejadas recolectadas en tubos EDTA K3 y Streck BCT. [19] Las ventajas de los tubos de estabilización celular pueden materializarse en situaciones en las que la sangre no puede procesarse en plasma inmediatamente.
Otros procedimientos también pueden reducir la cantidad de ADN de tipo salvaje "contaminante" y hacer que la detección de ctDNA sea más factible: [19]
El principal atractivo del análisis de ctDNA es que se extrae de forma no invasiva a través de la extracción de sangre. La adquisición de cfDNA o ctDNA generalmente requiere la recolección de aproximadamente 3 ml de sangre en tubos recubiertos con EDTA . El uso de EDTA es importante para reducir la coagulación de la sangre. Las fracciones de plasma y suero de la sangre se pueden separar mediante un paso de centrifugación. A partir de estas fracciones se puede extraer posteriormente ctDNA o cfDNA. Aunque el suero tiende a tener mayores niveles de cfDNA, esto se atribuye principalmente al ADN de los linfocitos. [21]Los niveles altos de cfDNA contaminante son subóptimos porque esto puede disminuir la sensibilidad de la detección de ctDNA. Por lo tanto, la mayoría de los estudios utilizan plasma para el aislamiento de ctDNA. Luego, el plasma se procesa nuevamente mediante centrifugación para eliminar las células sanguíneas intactas residuales. El sobrenadante se usa para la extracción de ADN, que se puede realizar usando kits disponibles en el mercado. [ cita requerida ]
