Las canalrodopsinas son una subfamilia de proteínas de retinilideno ( rodopsinas ) que funcionan como canales iónicos activados por la luz . [1] Sirven como fotorreceptores sensoriales en algas verdes unicelulares , controlando la fototaxis : movimiento en respuesta a la luz. [2] Expresados en células de otros organismos, permiten que la luz controle la excitabilidad eléctrica , la acidez intracelular , la entrada de calcio y otros procesos celulares (ver optogenética ). La canalrodopsina-1 (ChR1) y la canalrodopsina-2 (ChR2) del organismo modelo Chlamydomonas reinhardtii son las primeras canalrodopsinas descubiertas. Se han clonado variantes de otras especies de algas y se esperan más.
Estructura
En términos de estructura, las canalrodopsinas son proteínas retinilideno . Son proteínas de siete transmembrana, como la rodopsina , y contienen el cromóforo all- trans - retinal isomerizable a la luz (un derivado aldehído de la vitamina A ). El cromóforo de la retina está unido covalentemente al resto de la proteína a través de una base de Schiff protonada . Mientras que la mayoría de las proteínas 7-transmembrana son receptores acoplados a proteína G que abren otros canales iónicos indirectamente a través de segundos mensajeros (es decir, son metabotrópicos ), las canalrodopsinas forman directamente canales iónicos (es decir, son ionotrópicos ). [4] Esto hace que la despolarización celular sea extremadamente rápida, robusta y útil para aplicaciones de bioingeniería y neurociencia, incluida la fotoestimulación .
Función
El ChR2 natural ("tipo salvaje") absorbe la luz azul con un espectro de absorción y acción máximo a 480 nm. [5] Cuando el complejo todo- trans -retinal absorbe un fotón , induce un cambio conformacional de todo- trans a 13- cis -retinal. Este cambio introduce uno más en la proteína transmembrana, abriendo el poro al menos a 6 Å. En milisegundos, la retina se relaja de nuevo a la forma todo-trans, cerrando el poro y deteniendo el flujo de iones. [4] La mayoría de las canalrodopsinas naturales son canales catiónicos inespecíficos que conducen iones H + , Na + , K + y Ca 2+ . Recientemente, se han descubierto canalrodopsinas conductoras de aniones . [6]
Diseñador-canalrodopsinas
Las canalrodopsinas son herramientas clave en optogenética . El extremo C-terminal de la canalrodopsina-2 se extiende hacia el espacio intracelular y puede ser reemplazado por proteínas fluorescentes sin afectar la función del canal. Este tipo de construcción de fusión puede ser útil para visualizar la morfología de las células que expresan ChR2. [7] [8] Se ha demostrado que las mutaciones puntuales cercanas al bolsillo de unión de la retina afectan las propiedades biofísicas de la canalrodopsina, lo que resulta en una variedad de herramientas diferentes.
Cinética
El cierre del canal después de la activación óptica puede retrasarse sustancialmente mutando los residuos de proteína C128 o D156. Esta modificación da como resultado canalrodopsinas súper sensibles que pueden abrirse mediante un pulso de luz azul y cerrarse mediante un pulso de luz verde o amarilla (opsinas de función escalonada). [9] [10] [11] La mutación del residuo E123 acelera la cinética del canal (ChETA), y los mutantes ChR2 resultantes se han utilizado para aumentar las neuronas hasta 200 Hz. [12] En general, las canalrodopsinas con cinética lenta son más sensibles a la luz a nivel de población, ya que los canales abiertos se acumulan con el tiempo incluso a niveles bajos de luz.
Amplitud de fotocorriente
Los mutantes H134R y T159C muestran un aumento de las fotocorriente, y una combinación de T159 y E123 (ET / TC) tiene fotocorriente ligeramente más grande y una cinética ligeramente más rápida que la ChR2 de tipo salvaje. [13] Entre las variantes de ChR, ChIEF, una quimera y mutante puntual de ChR1 y ChR2, muestra las fotocorrentes más grandes y la menor desensibilización y tiene una cinética similar a la de ChR2 de tipo salvaje. [14]
Longitud de onda
Se han desarrollado canalrodopsinas quiméricas combinando hélices transmembrana de ChR1 y VChR1, lo que conduce al desarrollo de ChR con cambios espectrales rojos (como C1V1 y ReaChR). [11] [15] ReaChR ha mejorado el tráfico de membranas y una fuerte expresión en células de mamíferos, y se ha utilizado para la activación transcraneal mínimamente invasiva de las motoneuronas del tronco encefálico . Las búsquedas de secuencias homólogas en otros organismos han producido canalrodpsinas desplazadas al rojo espectralmente mejoradas y más fuertes (Chrimson). [16] En combinación con ChR2, estas canalrodopsinas sensibles a la luz amarilla / roja permiten controlar dos poblaciones de neuronas de forma independiente con pulsos de luz de diferentes colores. [17]
Se ha descubierto una canalrodopsina desplazada al azul en el alga Scherffelia dubia . Después de un poco de ingeniería para mejorar el tráfico y la velocidad de la membrana, la herramienta resultante (CheRiff) produjo grandes fotocorrientes a una excitación de 460 nm. [18] Se ha combinado con el indicador de calcio codificado genéticamente jRCaMP1b [19] en un sistema totalmente óptico llamado OptoCaMP. [20]
Selectividad de iones
La mutación L132C (CatCh) aumenta la permeabilidad al calcio y genera corrientes muy grandes. [21] La mutación de E90 en el aminoácido con carga positiva arginina convierte a la canalrodopsina de un canal catiónico inespecífico en un canal conductor de cloruro (ChloC). [22] La selectividad para Cl- se mejoró aún más reemplazando residuos cargados negativamente en el poro del canal, haciendo que el potencial de inversión sea más negativo. [23] [24] Las canalrodopsinas conductoras de cloruro selectivas (iChloC, iC ++, Gt ACR) inhiben los picos neuronales en cultivos celulares y en animales intactos cuando se iluminan con luz azul.
Aplicaciones
Las canalrodopsinas se pueden expresar fácilmente en células excitables tales como neuronas usando una variedad de técnicas de transfección ( transfección viral , electroporación , pistola de genes ) o animales transgénicos . El pigmento retiniano que absorbe la luz está presente en la mayoría de las células (de los vertebrados ) como vitamina A , lo que permite fotoestimular las neuronas sin añadir ningún compuesto químico. Antes del descubrimiento de las canalrodopsinas, los neurocientíficos se limitaban a registrar la actividad de las neuronas en el cerebro y correlacionar esta actividad con el comportamiento. Esto no es suficiente para demostrar que la actividad neuronal registrada realmente causó ese comportamiento. El control de redes de células modificadas genéticamente con luz, un campo emergente conocido como Optogenética , permite ahora a los investigadores explorar el vínculo causal entre la actividad en un grupo específico de neuronas y eventos mentales , por ejemplo, la toma de decisiones . Se ha demostrado el control óptico del comportamiento en nematodos, moscas de la fruta, pez cebra y ratones. [25] [26] Recientemente, se han diseñado canalrodopsinas conductoras de cloruro y también se han encontrado en la naturaleza. [6] [22] Estas herramientas se pueden utilizar para silenciar neuronas en cultivos celulares y en animales vivos mediante la inhibición de la derivación . [23] [24]
El uso de múltiples colores de luz amplía las posibilidades de los experimentos optogenéticos . El ChR2 sensible a la luz azul y la halodopsina de la bomba de cloruro activada por la luz amarilla permiten la activación óptica de múltiples colores y el silenciamiento de la actividad neuronal. [27] [28] VChR1 del alga colonial Volvox carteri absorbe al máximo a 535 nm y se ha utilizado para estimular células con luz amarilla (580 nm), aunque las fotocorriente generadas por VChR1 suelen ser muy pequeñas. [29] Sin embargo, los híbridos VChR1-ChR2 se han desarrollado mediante evolución dirigida que muestran una excitación máxima a 560 nm y un 50% de la absorbancia máxima a longitudes de onda superiores a 600 nm. [15] [30]
Usando ChR2 marcado con fluorescencia, se pueden identificar axones y sinapsis estimulados por luz . [8] Esto es útil para estudiar los eventos moleculares durante la inducción de plasticidad sináptica . [31] Las redes neuronales cultivadas transfectadas pueden estimularse para realizar algunos comportamientos deseados para aplicaciones en robótica y control. [32] ChR2 también se ha utilizado para mapear conexiones de largo alcance de un lado del cerebro al otro, y para mapear la ubicación espacial de entradas en el árbol dendrítico de neuronas individuales. [33] [34]
La función visual en ratones ciegos se puede restaurar parcialmente expresando ChR2 en las células internas de la retina. [35] [36] En el futuro, ChR2 podría encontrar aplicaciones médicas, por ejemplo, en formas de degeneración de la retina o para la estimulación cerebral profunda . Se ha demostrado que los implantes cocleares ópticos funcionan bien en experimentos con animales y podrían conducir a la primera aplicación de optogenética en pacientes humanos. [37] [38] [39] En 2021 se informó una aplicación optogenética de la proteína en un paciente humano con recuperación parcial de la función visual. [40] [41]
Historia
La motilidad y la fotoorientación de las microalgas ( fototaxis ) se han estudiado durante más de cien años en muchos laboratorios de todo el mundo.
En 1980, Ken Foster desarrolló la primera teoría coherente sobre la funcionalidad de los ojos de las algas. [42] También analizó los espectros de acción publicados y complementó las células ciegas con retina y análogos de la retina, lo que llevó a la conclusión de que el fotorreceptor para las respuestas de motilidad en Chlorophyceae es la rodopsina . [43]
Las fotocorrientes de Chlorophyceae Heamatococcus pluvialis y Chlamydomonas reinhardtii se estudiaron durante muchos años en los grupos de Oleg Sineshchekov y Peter Hegemann , lo que resultó en dos publicaciones seminales en los años 1978 y 1991. [44] [45] Basado en espectroscopía de acción y grabaciones simultáneas de fotocorrientes y batidos flagelares, se determinó que las corrientes de los fotorreceptores y los movimientos flagelares posteriores están mediados por la rodopsina y controlan la fototaxis y las respuestas fotofóbicas. El aumento extremadamente rápido de la corriente de los fotorreceptores después de un breve destello de luz llevó a la conclusión de que la rodopsina y el canal están íntimamente ligados en un complejo proteico, o incluso dentro de una sola proteína. [46] [47]
Sin embargo, la purificación bioquímica de los fotorreceptores de rodopsina no tuvo éxito durante muchos años.
Las secuencias de nucleótidos de las rodopsinas ahora llamadas canalrodopsinas ChR1 y ChR2 finalmente se descubrieron en un proyecto de secuenciación EST a gran escala en C. reinhardtii . La presentación independiente de las mismas secuencias a GenBank por parte de tres grupos de investigación generó confusión sobre su denominación: los nombres cop-3 y cop-4 fueron utilizados para la presentación inicial por el grupo de Hegemann; [48] CSOA y CSOB por el grupo de Spudich; [2] y acop-1 y acop-2 del grupo de Takahashi. [49] Se descubrió que ambas secuencias funcionan como canales de cationes activados por luz de un solo componente en ovocitos de Xenopus y células de riñón humano (HEK) por Georg Nagel, Ernst Bamberg, Peter Hegemann y otros. [1] [4]
El nombre "canalrodopsina" fue acuñado para resaltar esta propiedad inusual, y las secuencias fueron renombradas en consecuencia. Mientras tanto, Oleg Sineshchekov, Kwang-Hwan Jung y John Spudich, [2] y Peter Berthold y Peter Hegemann caracterizaron su papel en la generación de corrientes de fotorreceptores en células de algas . [50]
En noviembre de 2004, Zhuo-Hua Pan presentó un artículo a Nature que informaba sobre la restauración de la vista en ratones ciegos transfectados con Channelrhodopsin, [ cita requerida ] pero el artículo fue rechazado [ cita requerida ] y finalmente se publicó en Neuron en 2006. [51]
Mientras tanto, en 2005, tres grupos establecieron secuencialmente ChR2 como una herramienta para el control remoto óptico ( optogenética ) genéticamente dirigido de neuronas , circuitos neuronales y comportamiento.
Al principio, el laboratorio de Karl Deisseroth (en un artículo publicado en agosto de 2005) demostró que ChR2 podría implementarse para controlar las neuronas de mamíferos in vitro , logrando una precisión temporal del orden de milisegundos (tanto en términos de demora en el pico como en términos de jitter temporal). [7] Este fue un hallazgo significativo, ya que, en primer lugar, todas las opsinas (microbianas y vertebradas) requieren la retina como cofactor sensible a la luz y no estaba claro si las células nerviosas centrales de los mamíferos contendrían niveles retinianos suficientes, pero lo hacen ; en segundo lugar, mostró, a pesar de la pequeña conductancia de un solo canal, potencia suficiente para impulsar las neuronas de los mamíferos por encima del umbral del potencial de acción; y, en tercer lugar, demostró que la canalrodopsina es la primera herramienta optogenética con la que se puede controlar la actividad neuronal con la precisión temporal con la que operan las neuronas (milisegundos). Una herramienta anterior para la fotoestimulación, cHARGe, demostró una prueba de principio en neuronas cultivadas [52] pero nunca fue utilizada por otros grupos, ya que operaba con una precisión del orden de segundos, era muy variable y no permitía el control de los potenciales de acción individuales. .
Posteriormente, los grupos de Peter Hegemann y Stefan Herlitze publicaron un segundo estudio que confirmó la capacidad de ChR2 para controlar la actividad de las neuronas de los vertebrados , en este momento en la médula espinal de los polluelos. [53] Este estudio fue el primero en el que ChR2 se expresó junto con un silenciador óptico, rodopsina -4 de vertebrados en este caso, demostrando por primera vez que las células excitables podían activarse y silenciarse usando estas dos herramientas simultáneamente, iluminando el tejido en diferentes longitudes de onda. .
Los grupos de Alexander Gottschalk y Ernst Bamberg (con Georg Nagel a la cabeza del experimento) demostraron que ChR2, si se expresa en neuronas o células musculares específicas, puede evocar comportamientos predecibles, es decir, puede controlar el sistema nervioso de un animal intacto, en este caso el invertebrado C. elegans . [54] Este fue el primer uso de ChR2 para controlar el comportamiento de un animal en un experimento optogenético, sometiendo un tipo de célula genéticamente especificada a control remoto óptico. Aunque ambos aspectos habían sido ilustrados a principios de ese año por otro grupo, el laboratorio de Miesenböck , desplegando el canal iónico P2X2 indirectamente controlado por luz, [55] fueron en adelante las opsinas microbianas como la canalrodopsina las que dominaron el campo del control remoto genéticamente dirigido de células excitables, debido a la potencia, velocidad, capacidad de orientación, facilidad de uso y precisión temporal de la activación óptica directa, no requiere ningún compuesto químico externo como ligandos enjaulados. [56]
Para superar sus principales desventajas: la pequeña conductancia de un solo canal (especialmente en estado estable), la limitación a una longitud de onda de excitación óptima (~ 470 nm, azul), así como el tiempo de recuperación relativamente largo, que no permite la activación controlada de las neuronas por encima de 20–40 Hz: el ChR2 se ha optimizado mediante ingeniería genética . Una mutación puntual H134R (intercambiando el aminoácido Histidina en la posición 134 de la proteína nativa por una Arginina) resultó en un aumento de la conductancia en estado estacionario, como se describe en un artículo de 2005 que también estableció a ChR2 como una herramienta optogenética en C. elegans . [54] En 2009, el laboratorio de Roger Tsien optimizó el ChR2 para aumentar aún más la conductancia en estado estable y redujo drásticamente la desensibilización al crear quimeras de ChR1 y ChR2 y mutar aminoácidos específicos, produciendo ChEF y ChIEF, lo que permitió la conducción de trenes de potenciales de acción hasta 100 Hz. [14] [57] En 2010, los grupos de Hegemann y Deisseroth introdujeron una mutación E123T en ChR2 nativo, produciendo ChETA, que tiene una cinética de activación y desactivación más rápida , lo que permite el control de los potenciales de acción individuales a frecuencias de hasta 200 Hz ( en tipos de células apropiados). [12] [14]
Los grupos de Hegemann y Deisseroth también descubrieron que la introducción de la mutación puntual C128S hace que la derivada de ChR2 resultante sea una herramienta de función escalonada: una vez "encendido" por la luz azul, ChR2 (C128S) permanece en el estado abierto hasta que se cambia. apagado por luz amarilla: una modificación que deteriora la precisión temporal, pero aumenta la sensibilidad a la luz en dos órdenes de magnitud. [9] También descubrieron y caracterizaron VChR1 en el alga multicelular Volvox carteri . VChR1 produce solo pequeñas fotocorrientes, pero con un espectro de absorción que se desplaza al rojo en relación con ChR2. [29] Utilizando partes de la secuencia ChR1, la amplitud de la fotocorriente se mejoró posteriormente para permitir la excitación de dos poblaciones neuronales en dos longitudes de onda distintas. [11]
El grupo de Deisseroth ha sido pionero en muchas aplicaciones en animales vivos, como el control remoto dirigido genéticamente en roedores in vivo , [58] la inducción optogenética del aprendizaje en roedores, [59] el tratamiento experimental de la enfermedad de Parkinson en ratas, [60] [61] y la combinación con fMRI (opto-fMRI). [62] Otros laboratorios han sido pioneros en la combinación de estimulación de ChR2 con imágenes de calcio para experimentos totalmente ópticos, [8] mapeo de circuitos neuronales de largo alcance [33] y locales [63] , expresión de ChR2 de un locus transgénico - directamente [64 ] o en el paradigma condicional Cre-lox [63] - así como la excitación de dos fotones de ChR2, lo que permite la activación de células individuales. [65] [66] [67]
En marzo de 2013, el Premio Cerebro (Premio Europeo de Investigación del Cerebro Grete Lundbeck) fue otorgado conjuntamente a Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Nagel por "su invención y refinamiento de la optogenética". [68] El mismo año, Hegemann y Nagel recibieron el Premio Louis-Jeantet de Medicina por "el descubrimiento de la canalrodopsina". En 2015, Boyden y Deisseroth recibieron el Premio Breakthrough en Ciencias de la Vida y en 2020, Miesenböck, Hegemann y Nagel recibieron el premio Shaw en Ciencias de la Vida y Medicina por el desarrollo de la optogenética.
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Otras lecturas
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enlaces externos
- OpenOptogenetics.org , una wiki completa sobre optogenética.
- Centro de recursos de optogenética / laboratorio Deisseroth
- Laboratorio de Boyden
- Laboratorio de Zhuo-Hua Pan
- Laboratorio hegemann
- El Brain Prize 2013 por la invención de la optogenética