Optogenética

La optogenética es una técnica biológica que implica el uso de luz para controlar neuronas que han sido modificadas genéticamente para expresar canales iónicos sensibles a la luz . Como tal, la optogenética es un método de neuromodulación que utiliza una combinación de técnicas de la óptica y la genética para controlar las actividades de las neuronas individuales en el tejido vivo, incluso dentro de animales que se mueven libremente. [1] En algunos usos, la optogenética también se refiere al monitoreo óptico de la actividad neuronal [1]o control de otras vías bioquímicas en células no neuronales (consulte la sección "Biología celular / vías de señalización celular" más adelante), [2] aunque estas actividades de investigación precedieron al uso de canales iónicos sensibles a la luz en las neuronas. [3] [4] Dado que algunos autores utilizan la optogenética para referirse únicamente al control óptico de la actividad de neuronas definidas genéticamente y no a estos enfoques de investigación adicionales, [5] [6] [7] el término optogenética es un ejemplo de polisemia .

El control neuronal se logra utilizando actuadores optogenéticos como canalrodopsina , halorhodopsina y arquerodopsina , mientras que el registro óptico de las actividades neuronales se puede realizar con la ayuda de sensores optogenéticos de calcio ( GCaMP ), liberación vesicular ( sinapto-pHluorina ), neurotransmisores ( GluSnFR ) o voltaje de membrana (quásares, sensores de potenciales de acción acelerados, arcontes). [8] [9] El control (o registro) de la actividad está restringido a neuronas genéticamente definidas y se realiza de una manera espacio-temporal específica mediante la luz.

En 2010, la optogenética fue elegida como el "Método del año" en todos los campos de la ciencia y la ingeniería por la revista de investigación interdisciplinaria Nature Methods . [10] Al mismo tiempo, la optogenética se destacó en el artículo sobre "Avances de la década" en la revista de investigación académica Science . [11] [12] [7]

En 1979, Francis Crick sugirió que controlar todas las células de un tipo en el cerebro y dejar las otras más o menos inalteradas es un verdadero desafío para la neurociencia. Francis Crick especuló que una tecnología que usa la luz podría ser útil para controlar la actividad neuronal con precisión temporal y espacial, pero en ese momento no existía una técnica para hacer que las neuronas respondieran a la luz.

A principios de la década de 1990, LC Katz y E Callaway habían demostrado que la luz podía liberar el glutamato. [13] Heberle y Büldt en 1994 ya habían mostrado una expresión heteróloga funcional de una bacteriorrodopsina para el flujo de iones activados por luz en la levadura. [14] Posteriormente, en 1995, Georg Nagel et al. y Ernst Bamberg probaron la expresión heteróloga de rodopsinas microbianas (también bacteriorrodopsina y también en un sistema no neural, ovocitos de Xenopus) (Nagel et al., 1995, FEBS Lett.) y mostraron corriente inducida por luz.

Richard Fork , [15] realizó un uso anterior de la luz para activar las neuronas , [15] quien demostró la activación con láser de las neuronas dentro del tejido intacto, aunque no de una manera genéticamente dirigida. Boris Zemelman y Gero Miesenböck , que emplearon neuronas de mamíferos cultivadas con rodopsina de Drosophila , informaron sobre el primer método dirigido genéticamente que utilizó luz para controlar las neuronas sensibilizadas con rodopsina . [16] En 2003, Zemelman y Miesenböck desarrollaron un segundo método para la activación de neuronas dependiente de la luz en el que los canales ionotrópicos individuales TRPV1, TRPM8 y P2X2 estaban activados por ligandos fotocapados en respuesta a la luz. [17] A partir de 2004, los grupos de Kramer e Isacoff desarrollaron interruptores de fotos orgánicos o compuestos "enjaulados reversiblemente" en colaboración con el grupo Trauner que podrían interactuar con canales iónicos introducidos genéticamente. [18] [19] La metodología TRPV1, aunque sin el disparador de iluminación, fue posteriormente utilizada por varios laboratorios para alterar la alimentación, la locomoción y la resistencia del comportamiento en animales de laboratorio. [20] [21] [22] Sin embargo, los enfoques basados ​​en la luz para alterar la actividad neuronal no se aplicaron fuera de los laboratorios originales, probablemente porque la canalrodopsina más fácil de emplear se clonó poco después. [23]

Peter Hegemann , estudiando la respuesta a la luz de las algas verdes en la Universidad de Regensburg, había descubierto fotocorriente que eran demasiado rápidas para ser explicadas por las clásicas rodopsinas animales acopladas a proteína g . [24] Trabajando en equipo con el electrofisiólogo Georg Nagel en el Instituto Max Planck en Frankfurt, pudieron demostrar que un solo gen del alga Chlamydomonas producía grandes fotocorrentes cuando se expresaba en el ovocito de una rana. [25] Para identificar las células que expresan, reemplazaron la cola citoplásmica de la proteína de las algas con la proteína fluorescente YFP , generando la primera herramienta optogenética de aplicación general. [23] Afirmaron en el artículo de 2003 que "la expresión de ChR2 en ovocitos o células de mamíferos puede usarse como una herramienta poderosa para aumentar la concentración de Ca2 + citoplásmico o para despolarizar la membrana celular, simplemente por iluminación".

Karl Deisseroth, del Departamento de Bioingeniería de Stanford, publicó las páginas del cuaderno de principios de julio de 2004 de su experimento inicial que muestra la activación de la luz de las neuronas que expresan una canalrodopsina. [26] En agosto de 2005, el laboratorio de Karl Deisseroth , que incluye a los estudiantes graduados Ed Boyden y Feng Zhang , en colaboración con Georg Nagel , publicó la primera demostración de un sistema optogenético de un solo componente, en neuronas [27] utilizando la canalrodopsina-2 ( Construcción H134R) -eYFP de Nagel y Hegemann. [23]

Zhuo-Hua Pan, de la Wayne State University , investigando cómo restaurar la vista a la ceguera, probó la canalrodopsina en las células ganglionares, las neuronas de nuestros ojos que se conectan directamente con el cerebro. La primera observación de Pan de la activación óptica de las neuronas de la retina con canalrodopsina fue en agosto de 2004, según Pan, [28] un mes después de la observación inicial de Deisseroth. De hecho, las neuronas transfectadas se volvieron eléctricamente activas en respuesta a la luz, y en 2005, Zhuo-Hua Pan informó sobre la transfección in vivo exitosa de canalrodopsina en células ganglionares retinianas de ratones y respuestas eléctricas a la fotoestimulación en cultivo de cortes retinianos. [29]

En abril de 2005, Susana Lima y Miesenböck informaron del primer uso de la fotoestimulación P2X2 dirigida genéticamente para controlar el comportamiento de un animal. [30] Demostraron que la fotoestimulación de grupos de neuronas circunscritos genéticamente, como los del sistema dopaminérgico , provocaba cambios de comportamiento característicos en las moscas de la fruta.

En octubre de 2005, Lynn Landmesser y Stefan Herlitze también publicaron el uso de canalrohodpsina-2 para controlar la actividad neuronal en neuronas cultivadas del hipocampo y circuitos de la médula espinal de pollo en embriones intactos en desarrollo. [31] Además, introdujeron por primera vez la rodopsina de vertebrados, un receptor acoplado a proteína G activado por luz, como una herramienta para inhibir la actividad neuronal a través del reclutamiento de vías de señalización intracelular también en las neuronas del hipocampo y el embrión de pollo en desarrollo intacto. [31]

Los grupos de Alexander Gottschalk y Georg Nagel crearon el primer mutante de ChR2 (H134R) y fueron los primeros en utilizar la canalrodopsina-2 para controlar la actividad neuronal en un animal intacto, lo que demuestra que los patrones motores en el gusano redondo Caenorhabditis elegans podrían evocar mediante la estimulación de luz genéticamente circuitos neuronales seleccionados (publicado en diciembre de 2005). [32] En ratones, la expresión controlada de herramientas optogenéticas a menudo se logra con métodos Cre / loxP específicos del tipo celular desarrollados para neurociencia por Joe Z. Tsien en la década de 1990 [33] para activar o inhibir regiones cerebrales y tipos celulares específicos en vivo. [34]

En 2007, los laboratorios de Edward Boyden y Karl Deisseroth (junto con los grupos de Alexander Gottschalk y Georg Nagel ) informaron simultáneamente una inhibición optogenética exitosa de la actividad en las neuronas. [35] [36]

En 2007, el grupo Georg Nagel y el grupo Peter Hegemann iniciaron la manipulación optogenética de cAMP. [37] En 2014, Avelar et al. informó el primer gen de rodopsina-guanilil ciclasa de un hongo. En 2015, Scheib et al. y Gao et al. caracterizó la actividad del gen de la rodopsina-guanilil ciclasa. Y Shiqiang Gao et al. y Georg Nagel , Alexander Gottschalk lo identificó como la primera rodopsina de la enzima 8 TM. [38]

Antes del desarrollo de actuadores optogénicos, se desarrollaron sensores optogenéticos de actividad, por ejemplo, indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). El primer GECI que se utilizó para visualizar la actividad en un animal fue el cameleon , diseñado por Atsushi Miyawaki, Roger Tsien y sus compañeros de trabajo en 1997. [4] Cameleon fue utilizado por primera vez con éxito en un animal por Rex Kerr, William Schafer y sus compañeros de trabajo para registrar las neuronas y células musculares del nematodo C. elegans . [39] Cameleon se utilizó posteriormente para registrar la actividad neuronal en moscas [40] y pez cebra. [41] En mamíferos, el primer GECI que se utilizó in vivo fue GCaMP , [42] desarrollado por primera vez por Nakai y colaboradores. [43] El GCaMP ha experimentado numerosas mejoras, y el GCaMP6 [44] en particular se ha utilizado ampliamente en la neurociencia.

El poderoso impacto de la tecnología optogenética en la investigación del cerebro ha sido reconocido por numerosos premios a actores clave en el campo.

En 2010, Georg Nagel , Peter Hegemann y Ernst Bamberg recibieron el Premio Wiley de Ciencias Biomédicas . [45] Georg Nagel , Peter Hegemann y Ernst Bamberg también recibieron el premio Karl Heinz Beckurts en 2010. [46] En 2010, Deisseroth recibió el premio inaugural HFSP Nakasone "por su trabajo pionero en el desarrollo de métodos optogenéticos para estudiar la función de las redes neuronales subyacentes al comportamiento ". [47]

En 2012, Georg Nagel , Peter Hegemann, Ernst Bamberg y Deisseroth recibieron el premio Zülch. En 2012, Miesenböck recibió el premio Baillet Latour Health Prize por "enfoques optogenéticos pioneros para manipular la actividad neuronal y controlar el comportamiento animal". [48]

En 2013, Nagel y Peter Hegemann recibieron el Premio Louis-Jeantet de Medicina . [49] En 2013, Bamberg, Boyden, Deisseroth, Hegemann, Miesenböck y Nagel recibieron el premio The Brain Prize por "su invención y refinamiento de la optogenética". [50] [51]

En 2017, Deisseroth recibió el Premio de Investigación Else Kröner Fresenius 2017 por "sus descubrimientos en optogenética y química de tejidos de hidrogel". Deisseroth fue galardonado con el Premio Kioto 2018 "por el desarrollo de la optogenética y la neurociencia de los sistemas causales" [52] y el Premio Heineken de Medicina 2020 de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos, por el desarrollo de la optogenética. [53]

En 2019, Ernst Bamberg , Georg Nagel , Ed Boyden , Karl Deisseroth , Peter Hegemann y Gero Miesenböck recibieron el Premio Rumford por "contribuciones extraordinarias relacionadas con la invención y el refinamiento de la optogenética", con. [54] En 2020, Miesenböck, Hegemann y Georg Nagel recibieron conjuntamente el premio Shaw en Ciencias de la Vida y Medicina por "el desarrollo de la optogenética".

Fig. 1. La canalrodopsina-2 (ChR2) induce una actividad impulsada por la luz azul temporalmente precisa en neuronas corticales prefrontales prelimbicas de rata. a) Esquema in vitro (izquierda) que muestra el suministro de luz azul y el registro de pinza de parche de células completas de la actividad evocada por la luz de una neurona piramidal que expresa CaMKllα :: ChR2-EYFP fluorescente (derecha) en un corte de cerebro agudo. b) Esquema in vivo (izquierda) que muestra el suministro de luz azul (473 nm) y el registro de una sola unidad. (abajo a la izquierda) Corte de cerebro coronal que muestra la expresión de CaMKllα :: ChR2-EYFP en la región preliminar. La flecha azul claro muestra la punta de la fibra óptica; La flecha negra muestra la punta del electrodo de registro (izquierda). Barra blanca, 100  µm . (abajo a la derecha) Registro de luz in vivo de la neurona cortical prefrontal en una rata CaMKllα :: ChR2-EYFP transducida que muestra picos evocados por luz a 20 Hz de suministro de pulsos de luz azul (derecha). Recuadro, respuesta representativa de una sola unidad evocada por la luz. [55]
Figura 2 . Halorhodopsin (NpHR) silencia rápida y reversiblemente la actividad espontánea in vivo en la corteza prefrontal prelímbica de rata. (Arriba a la izquierda) Esquema que muestra el suministro de luz verde in vivo (532 nm) y el registro de una sola unidad de una neurona piramidal que expresa CaMKllα :: eNpHR3.0- EYFP espontáneamente activa. (Derecha) Traza de ejemplo que muestra que la iluminación continua de 532 nm inhibe la actividad de una sola unidad in vivo . Recuadro, evento representativo de una sola unidad; Barra verde, 10 segundos. [55]
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Nematodo que expresa el canal iónico sensible a la luz Mac. Mac es una bomba de protones originalmente aislada en el hongo Leptosphaeria maculans y ahora expresada en las células musculares de C. elegans que se abre en respuesta a la luz verde y causa inhibición hiperpolarizante. Es de destacar la extensión en la longitud del cuerpo que experimenta el gusano cada vez que se expone a la luz verde, que presumiblemente es causada por los efectos relajantes musculares de Mac. [56]
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Nematodo que expresa ChR2 en su grupo de músculos gubernacular-oblicuo que responde a la estimulación por luz azul. La estimulación con luz azul hace que los músculos gubernativos oblicuos se contraigan repetidamente, provocando empujes repetitivos de la espícula , como se vería naturalmente durante la cópula. [57]

La optogenética proporciona una precisión temporal a escala de milisegundos que permite al experimentador seguir el ritmo del procesamiento rápido de la información biológica (por ejemplo, al sondear el papel causal de patrones de potencial de acción específicos en neuronas definidas). De hecho, para sondear el código neuronal, la optogenética, por definición, debe operar en una escala de tiempo de milisegundos para permitir la adición o eliminación de patrones de actividad precisos dentro de células específicas en los cerebros de animales intactos, incluidos los mamíferos (ver Figura 1) . En comparación, la precisión temporal de las manipulaciones genéticas tradicionales (empleadas para investigar el papel causal de genes específicos dentro de las células, a través de cambios de "pérdida de función" o "ganancia de función" en estos genes) es bastante lenta, desde horas o días. a meses. También es importante tener lecturas rápidas en optogenética que puedan seguir el ritmo del control óptico. Esto se puede hacer con registros eléctricos ("optrodes") o con proteínas informadoras que son biosensores , donde los científicos han fusionado proteínas fluorescentes con proteínas detectoras. Un ejemplo de esto es la proteína fluorescente sensible al voltaje (VSFP2). [58] Además, más allá de su impacto científico, la optogenética representa un estudio de caso importante en el valor de la conservación ecológica (ya que muchas de las herramientas clave de la optogenética surgen de organismos microbianos que ocupan nichos ambientales especializados) y en la importancia de la ciencia básica pura como estas opsinas fueron estudiadas durante décadas por su propio bien por biofísicos y microbiólogos, sin involucrar la consideración de su valor potencial en la entrega de conocimientos sobre la neurociencia y la enfermedad neuropsiquiátrica. [59]

Proteínas activadas por luz: canales, bombas y enzimas

Por lo tanto, el sello distintivo de la optogenética es la introducción de canales, bombas y enzimas rápidos activados por la luz que permiten una manipulación temporal precisa de eventos eléctricos y bioquímicos mientras se mantiene la resolución del tipo celular mediante el uso de mecanismos específicos de orientación. Entre las opsinas microbianas que pueden usarse para investigar la función de los sistemas neurales se encuentran las canalrodopsinas (ChR2, ChR1, VChR1 y SFO) para excitar las neuronas y las canalrodopsinas conductoras de aniones para la inhibición inducida por la luz. Recientemente se han diseñado canales de potasio controlados por luz indirecta para evitar la generación de potencial de acción en las neuronas durante la iluminación con luz azul. [60] [61] Las bombas de iones impulsadas por luz también se utilizan para inhibir la actividad neuronal, p. Ej., Clorhodopsina (NpHR), [62] halodopsinas mejoradas (eNpHR2.0 y eNpHR3.0, ver Figura 2), [63] arquerodopsina (Arch ), opsinas fúngicas (Mac) y bacteriorrodopsina mejorada (eBR). [64]

El control optogenético de eventos bioquímicos bien definidos dentro de los mamíferos que se comportan ahora también es posible. Sobre la base de un trabajo previo de fusión de opsinas de vertebrados con receptores acoplados a proteína G específicos [65] , se creó una familia de herramientas optogenéticas quiméricas de un solo componente que permitieron a los investigadores manipular dentro de los mamíferos que se comportaban, la concentración de mensajeros intracelulares definidos como cAMP e IP3 en células objetivo. . [66] Otros enfoques bioquímicos de la optogenética (fundamentalmente, con herramientas que mostraban baja actividad en la oscuridad) siguieron poco después, cuando se logró el control óptico sobre pequeñas GTPasas y adenilil ciclasa en células cultivadas utilizando estrategias novedosas de varios laboratorios diferentes. [67] [68] [69] Se han descubierto adenilil ciclasas fotoactivadas en hongos y se han utilizado con éxito para controlar los niveles de cAMP en neuronas de mamíferos. [70] [71] Este repertorio emergente de actuadores optogenéticos ahora permite el control específico del tipo celular y temporalmente preciso de múltiples ejes de la función celular dentro de animales intactos. [72]

Hardware para aplicaciones ligeras

Otro factor necesario es el hardware (por ejemplo, fuentes de luz de estado sólido y de fibra óptica integradas) para permitir el control de tipos de células específicas, incluso en las profundidades del cerebro, en animales que se comportan libremente. Más comúnmente, esto último ahora se logra utilizando la tecnología de diodos acoplados de fibra óptica introducida en 2007, [73] [74] [75] aunque para evitar el uso de electrodos implantados, los investigadores han diseñado formas de inscribir una "ventana" hecha de zirconia que ha sido modificado para ser transparente e implantado en cráneos de ratones, para permitir que las ondas ópticas penetren más profundamente para estimular o inhibir neuronas individuales. [76] Para estimular áreas cerebrales superficiales como la corteza cerebral, se pueden montar fibras ópticas o LED directamente en el cráneo del animal. Se han utilizado fibras ópticas implantadas más profundamente para llevar luz a áreas cerebrales más profundas. Como complemento de los enfoques de fibra óptica, se han desarrollado técnicas completamente inalámbricas que utilizan energía suministrada de forma inalámbrica a LED en la cabeza para el estudio sin obstáculos de comportamientos complejos en organismos que se comportan libremente. [77] Los avances recientes investigan el uso de LED orgánicos (OLED) como estímulos para la optogenética. [78] La estimulación precisa y controlada de las neuronas que expresan opsina microbiana se ha demostrado in vitro en una escala de tiempo del orden de un milisegundo. El funcionamiento en modo pulsado permite la estimulación neuronal dentro de una temperatura baja compatible. Además, los diodos emisores de luz orgánicos (OLED) son adecuados para la implantación en el cerebro por su espesor muy delgado que puede ser inferior a 1 μm. [78]

Expresión de actuadores optogenéticos

La optogenética también incluye necesariamente el desarrollo de estrategias de orientación genética, como promotores específicos de células u otros virus condicionalmente activos personalizados, para enviar las sondas sensibles a la luz a poblaciones específicas de neuronas en el cerebro de animales vivos (p. Ej., Gusanos, moscas de la fruta, ratones). , ratas y monos). En invertebrados como gusanos y moscas de la fruta, cierta cantidad de todo-trans-retinal (ATR) se complementa con alimentos. Una ventaja clave de las opsinas microbianas como se señaló anteriormente es que son completamente funcionales sin la adición de cofactores exógenos en los vertebrados. [75]

Los tres componentes principales en la aplicación de la optogenética son los siguientes (A) Identificación o síntesis de una proteína sensible a la luz (opsina) como la canalrodopsina-2 (ChR2), la halorhodopsina (NpHR), etc ... (B) El diseño de un sistema para introducir el material genético que contiene la opsina en las células para la expresión de proteínas, como la aplicación de Cre recombinasa o una aplicación de virus adenoasociado (C) de instrumentos emisores de luz. [79]

La técnica de uso de la optogenética es flexible y adaptable a las necesidades del experimentador. Para empezar, los experimentadores diseñan genéticamente una opsina microbiana basándose en las propiedades de activación (tasa de excitabilidad, período refractario, etc.) necesarias para el experimento.

Es un desafío introducir la opsina microbiana, un actuador optogenético, en una región específica del organismo en cuestión. Un enfoque rudimentario es introducir un vector viral diseñado que contiene el gen actuador optogenético unido a un promotor reconocible como CAMKIIα . Esto permite cierto nivel de especificidad, ya que las células que ya contienen y pueden traducir el promotor dado se infectarán con el vector viral y, con suerte, expresarán el gen actuador optogenético.

Otro enfoque es la creación de ratones transgénicos en los que el gen actuador optogenético se introduce en cigotos de ratones con un promotor determinado, más comúnmente Thy1 . La introducción del actuador optogenético en una etapa temprana permite incorporar un código genético más grande y, como resultado, aumenta la especificidad de las células que se van a infectar.

Un tercer enfoque bastante novedoso que se ha desarrollado es la creación de ratones transgénicos con Cre recombinasa , una enzima que cataliza la recombinación entre dos sitios lox-P. Luego, al introducir un vector viral diseñado que contiene el gen actuador optogenético entre dos sitios lox-P, solo las células que contienen la recombinasa Cre expresarán la opsina microbiana. Esta última técnica ha permitido el uso de múltiples actuadores optogenéticos modificados sin la necesidad de crear una línea completa de animales transgénicos cada vez que se necesita una nueva opsina microbiana.

Después de la introducción y expresión de la opsina microbiana, dependiendo del tipo de análisis que se realice, la aplicación de luz se puede colocar en los extremos terminales o en la región principal donde se encuentran las células infectadas. La estimulación con luz se puede realizar con una amplia gama de instrumentos, desde diodos emisores de luz (LED) o láser de estado sólido bombeado por diodos (DPSS). Estas fuentes de luz se conectan más comúnmente a una computadora a través de un cable de fibra óptica. Los avances recientes incluyen la llegada de dispositivos inalámbricos montados en la cabeza que también aplican LED a áreas específicas y, como resultado, le dan al animal más libertad de movilidad para reproducir resultados in vivo . [80] [81]

Aunque ya es una poderosa herramienta científica, la optogenética, según Doug Tischer & Orion D. Weiner de la Universidad de California en San Francisco, debe considerarse como una " GFP de primera generación " debido a su inmenso potencial tanto de utilización como de optimización. [82] Dicho esto, el enfoque actual de la optogenética está limitado principalmente por su versatilidad. Incluso dentro del campo de la neurociencia donde es más potente, la técnica es menos robusta a nivel subcelular. [83] La respuesta espacial plantea otros problemas a nivel de redes neuronales.

Expresión selectiva

Uno de los principales problemas de la optogenética es que no todas las células en cuestión pueden expresar el gen de la opsina microbiana al mismo nivel. Por lo tanto, incluso la iluminación con una intensidad de luz definida tendrá efectos variables en las células individuales. La estimulación optogenética de las neuronas en el cerebro está aún menos controlada ya que la intensidad de la luz cae exponencialmente de la fuente de luz (por ejemplo, fibra óptica implantada).

Además, el modelado matemático muestra que la expresión selectiva de opsina en tipos de células específicos puede alterar drásticamente el comportamiento dinámico de los circuitos neuronales. En particular, la estimulación optogenética que se dirige preferentemente a las células inhibidoras puede transformar la excitabilidad del tejido neural de Tipo 1, donde las neuronas operan como integradoras, a Tipo 2, donde las neuronas operan como resonadores. [84]

Los medios excitables de tipo 1 mantienen ondas de propagación de actividad, mientras que los medios excitables de tipo 2 no lo hacen. La transformación de uno a otro explica cómo la estimulación óptica constante de la corteza motora de los primates provoca oscilaciones de banda gamma (40-80 Hz) a la manera de un medio excitable de tipo 2. Sin embargo, esas mismas oscilaciones se propagan lejos en el tejido circundante a la manera de un medio excitable de Tipo 1. [85]

Sigue siendo difícil dirigir la opsina a compartimentos subcelulares definidos, por ejemplo, la membrana plasmática, las vesículas sinápticas o las mitocondrias. [63] [83] Restringir la opsina a regiones específicas de la membrana plasmática, como las dendritas , los somas o los terminales axónicos , proporcionaría una comprensión más sólida de los circuitos neuronales. [83]

Cinética y sincronización

Un problema con la canalrodopsina-2 es que sus propiedades de activación no imitan los canales catiónicos in vivo de las neuronas corticales. Una solución a este problema con la propiedad cinética de una proteína es la introducción de variantes de canalrodopsina-2 con cinéticas más favorables. [55] [56]

Otra de las limitaciones de la técnica es que la estimulación lumínica produce una activación sincrónica de las células infectadas y esto elimina las propiedades de activación de las células individuales entre la población afectada. Por lo tanto, es difícil comprender cómo las células de la población afectada se comunican entre sí o cómo sus propiedades fásicas de activación pueden relacionarse con los circuitos que se están observando.

La activación optogenética se ha combinado con la resonancia magnética funcional (ofMRI) para dilucidar el conectoma , un mapa completo de las conexiones neuronales del cerebro. Los resultados, sin embargo, están limitados por las propiedades generales de fMRI . [83] [86] Las lecturas de este procedimiento de neuroimagen carecen de la resolución espacial y temporal apropiada para estudiar los circuitos neuronales densamente empaquetados y de disparo rápido. [86]

Espectro de absorción de luz

Las proteínas de opsina actualmente en uso tienen picos de absorción en todo el espectro visual, pero siguen siendo considerablemente sensibles a la luz azul. [83] Esta superposición espectral hace que sea muy difícil combinar la activación de opsina con indicadores codificados genéticamente ( GEVI , GECI , GluSnFR , sinapto -pHluorina ), la mayoría de los cuales necesitan excitación con luz azul. Las opsinas con activación infrarroja aumentarían, a un valor de irradiancia estándar, la penetración de la luz y la resolución mediante la reducción de la dispersión de la luz.

Los datos adicionales indican que los espectros de absorción de colorantes orgánicos y proteínas fluorescentes, utilizados en aplicaciones optogenéticas, se extienden desde alrededor de 250 nm hasta alrededor de 600 nm. Los compuestos orgánicos particulares usados ​​en porciones discretas de este rango incluyen: retinales, flavinas, folatos, ácidos p-cumáricos, cromofotos de fitocromo, cobalaminas y al menos seis proteínas fluorescentes, incluidas mOrange y mCherry. [87]

Respuesta espacial

El uso de un haz de luz gaussiano estrecho para estimular las neuronas en un parche de tejido neural puede evocar un perfil de respuesta que es mucho más amplio que el perfil de estimulación. [88] En este caso, las neuronas pueden activarse (o inhibirse) involuntariamente. Existen herramientas de simulación computacional [89] [90] que pueden ayudar a contrarrestar esto estimando el impacto de la estimulación optogenética antes de realizar experimentos.

El campo de la optogenética ha fomentado la comprensión científica fundamental de cómo los tipos de células específicos contribuyen a la función de los tejidos biológicos, como los circuitos neuronales in vivo (véanse las referencias de la literatura científica a continuación). Además, desde el punto de vista clínico, la investigación impulsada por la optogenética ha permitido comprender mejor la enfermedad de Parkinson [91] [92] y otros trastornos neurológicos y psiquiátricos. De hecho, los artículos sobre optogenética de 2009 también han proporcionado información sobre los códigos neuronales relevantes para el autismo , la esquizofrenia , el abuso de drogas , la ansiedad y la depresión . [64] [93] [94] [95] La optogenética también es un tratamiento experimental directo para la ceguera. [96]

Identificación de redes y neuronas particulares

Amígdala

Se han utilizado enfoques optogenéticos para mapear circuitos neuronales en la amígdala que contribuyen al condicionamiento del miedo . [97] [98] [99] [100] Un ejemplo de un circuito neuronal es la conexión que se realiza desde la amígdala basolateral a la corteza prefrontal dorsal-medial, donde se han observado oscilaciones neuronales de 4 Hz en correlación con las conductas de congelación inducidas por el miedo. en ratones. A los ratones transgénicos se les introdujo canalrodoposina-2 unida con un promotor de parvalbúmina -Cre que infectó selectivamente las interneuronas ubicadas tanto en la amígdala basolateral como en la corteza prefrontal dorsal-medial responsable de las oscilaciones de 4 Hz. Las interneuronas fueron estimuladas ópticamente generando un comportamiento de congelación y como resultado proporcionaron evidencia de que estas oscilaciones de 4 Hz pueden ser responsables de la respuesta de miedo básica producida por las poblaciones neuronales a lo largo de la corteza prefrontal dorsal-medial y la amígdala basolateral. [101]

Bulbo olfatorio

La activación optogenética de las neuronas sensoriales olfativas fue fundamental para demostrar el tiempo en el procesamiento del olor [102] y para el mecanismo de conductas guiadas olfativamente mediadas por neuromoduladores (p. Ej. , Agresión , apareamiento ) [103]. Además, con la ayuda de la optogenética, se han reproducido pruebas para demostrar que la "imagen residual" de los olores se concentra más centralmente alrededor del bulbo olfatorio que en la periferia donde se ubicarían las neuronas receptoras olfativas. Se estimularon ratones transgénicos infectados con canal-rodopsina Thy1-ChR2 con un láser de 473 nm colocado transcranealmente sobre la sección dorsal del bulbo olfatorio. La fotoestimulación más prolongada de las células mitrales en el bulbo olfatorio condujo a observaciones de una actividad neuronal más duradera en la región después de que la fotoestimulación había cesado, lo que significa que el sistema sensorial olfatorio puede sufrir cambios a largo plazo y reconocer las diferencias entre los olores antiguos y nuevos. [104]

Núcleo accumbens

La optogenética, el comportamiento de los mamíferos en movimiento libre, la electrofisiología in vivo y la fisiología del corte se han integrado para sondear las interneuronas colinérgicas del núcleo accumbens mediante excitación o inhibición directa. A pesar de representar menos del 1% de la población total de neuronas accumbales, estas células colinérgicas son capaces de controlar la actividad de las terminales dopaminérgicas que inervan neuronas espinosas medianas (MSN) en el núcleo accumbens. [105] Se sabe que estos MSN accumbales están involucrados en la vía neural a través de la cual la cocaína ejerce sus efectos, porque se ha demostrado que la disminución de los cambios inducidos por la cocaína en la actividad de estas neuronas inhibe el condicionamiento de la cocaína . Las pocas neuronas colinérgicas presentes en el núcleo accumbens pueden resultar objetivos viables para la farmacoterapia en el tratamiento de la dependencia de la cocaína [64].

La corteza prefrontal

Jaulas para ratas equipadas con conmutadores optogenéticos que permiten el estudio in vivo del comportamiento animal durante las estimulaciones optogenéticas.

Los registros in vivo e in vitro de CAMKII AAV-ChR2 individuales que expresan neuronas piramidales dentro de la corteza prefrontal demostraron una salida de potencial de acción de alta fidelidad con pulsos cortos de luz azul a 20 Hz ( Figura 1 ). [55]

Corteza motora

La estimulación optogenética repetida in vivo en animales sanos fue capaz de inducir eventualmente convulsiones. [106] Este modelo se ha denominado optoencendido.

Corteza piriforme

La estimulación optogenética repetida in vivo de células piramidales de la corteza piriforme en animales sanos pudo finalmente inducir convulsiones. [107] Los estudios in vitro han revelado una pérdida de la inhibición por retroalimentación en el circuito piriforme debido a la síntesis deficiente de GABA. [107]

Corazón

La optogenética se aplicó en los cardiomiocitos auriculares para acabar con las arritmias de ondas espirales , que se encuentran en la fibrilación auricular , con luz. [108] Este método aún se encuentra en la etapa de desarrollo. Un estudio reciente exploró las posibilidades de la optogenética como método para corregir arritmias y resincronizar la estimulación cardíaca. El estudio introdujo canalrodopsina-2 en cardiomiocitos en áreas ventriculares de corazones de ratones transgénicos y realizó estudios in vitro de fotoestimulación en ratones de cavidad abierta y cerrada. La fotoestimulación condujo a una mayor activación de las células y, por lo tanto, a un aumento de las contracciones ventriculares, lo que resultó en un aumento de la frecuencia cardíaca. Además, este enfoque se ha aplicado en la terapia de resincronización cardíaca ( TRC ) como un nuevo marcapasos biológico como sustituto de la TRC basada en electrodos. [109] Últimamente, la optogenética se ha utilizado en el corazón para desfibrilar arritmias ventriculares con iluminación epicárdica local, [110] una iluminación generalizada de todo el corazón [111] o con patrones de estimulación personalizados basados ​​en mecanismos arritmogénicos para disminuir la energía de desfibrilación. [112]

Ganglio espiral

La estimulación optogenética del ganglio espiral en ratones sordos restauró la actividad auditiva. [113] La aplicación optogenética en la región coclear permite la estimulación o inhibición de las células ganglionares espirales (SGN). Además, debido a las características de los potenciales de reposo de los SGN, se han empleado diferentes variantes de la proteína canalrodopsina-2 como Chronos, [114] CatCh y f-Chrimson. [115] Las variantes Chronos y CatCh son particularmente útiles porque pasan menos tiempo en sus estados desactivados, lo que permite más actividad con menos ráfagas de luz azul emitidas. Además, el uso de canales desplazados al rojo diseñados como f-Chrimson permite la estimulación con longitudes de onda más largas, lo que disminuye los riesgos potenciales de fototoxicidad a largo plazo sin comprometer la velocidad de activación. [116] El resultado es que el LED que produce la luz requeriría menos energía y la idea de prótesis cocleares en asociación con fotoestimulación sería más factible. [117]

Tronco encefálico

La estimulación optogenética de una canalrodopsina excitable de luz roja modificada (ReaChR) expresada en el núcleo motor facial permitió la activación mínimamente invasiva de las motoneuronas efectivas para impulsar los movimientos de los bigotes en ratones. [118] Un estudio novedoso empleó optogenética en el núcleo dorsal del rafe para activar e inhibir la liberación dopaminérgica en el área tegmental ventral. Para producir la activación, se infectaron ratones transgénicos con canalrodopsina-2 con un promotor TH-Cre y para producir inhibición se añadió la opsina hiperpolarizante NpHR al promotor TH-Cre. Los resultados mostraron que la activación óptica de las neuronas dopaminérgicas condujo a un aumento de las interacciones sociales y su inhibición disminuyó la necesidad de socializar solo después de un período de aislamiento. [119]

Sistema visual

Estudiar el sistema visual usando optogenética puede ser un desafío. De hecho, la luz utilizada para el control optogenético puede conducir a la activación de fotorreceptores, como resultado de la proximidad entre los circuitos visuales primarios y estos fotorreceptores. En este caso, la selectividad espacial es difícil de lograr (particularmente en el caso del lóbulo óptico de la mosca). Por lo tanto, el estudio del sistema visual requiere una separación espectral, utilizando canales que se activan por diferentes longitudes de onda de luz que las rodopsinas dentro de los fotorreceptores (activación máxima a 480 nm para la rodopsina 1 en Drosophila ). La CsChrimson [120] desplazada al rojo o la canalrodopsina biestable [121] se utilizan para la activación optogenética de las neuronas (es decir, la despolarización ), ya que ambas permiten la separación espectral. Con el fin de lograr el silenciamiento neuronal (es decir, la hiperpolarización ), se descubrió un canal aniónico-rodopsina en la especie de algas criptofitas Guillardia theta (denominada GtACR1). [122] se puede utilizar. GtACR1 es más sensible a la luz que otros canales inhibidores como la clase de bombas de cloruro Halorhodopsin e imparte una fuerte conductancia. Como su pico de activación (515 nm) es cercano al de la rodopsina 1, es necesario calibrar cuidadosamente la iluminación optogenética así como el estímulo visual. Los factores a tener en cuenta son la longitud de onda de la iluminación optogenética (posiblemente superior al pico de activación de GtACR1), el tamaño del estímulo (para evitar la activación de los canales por la luz del estímulo) y la intensidad de la optogenética. iluminación. Se ha demostrado que GtACR1 puede ser una herramienta inhibidora útil en el estudio optogenético del sistema visual de Drosophila al silenciar la expresión de las neuronas T4 / T5. [123] Estos estudios también pueden realizarse en animales que se comportan intactos, por ejemplo, para sondear la respuesta optomotora .

Control temporal preciso de las intervenciones

Los actuadores optogenéticos actualmente disponibles permiten el control temporal preciso de la intervención requerida (es decir, la inhibición o excitación de las neuronas objetivo) con una precisión que desciende rutinariamente al nivel de milisegundos. [124] Sin embargo, la precisión temporal varía entre los actuadores optogenéticos, [125] y depende de la frecuencia y la intensidad de la estimulación. [88]

Ahora se pueden diseñar experimentos en los que la luz utilizada para la intervención sea activada por un elemento particular de la conducta (para inhibir la conducta), un estímulo incondicionado particular (para asociar algo a ese estímulo) o un evento oscilatorio particular en el cerebro (para inhibir la conducta). el evento). Este tipo de enfoque ya se ha utilizado en varias regiones del cerebro:

Hipocampo

Las ondas agudas y los complejos de ondulación (SWR) son eventos oscilatorios de alta frecuencia distintos en el hipocampo que se cree que juegan un papel en la formación y consolidación de la memoria. Estos eventos pueden detectarse fácilmente siguiendo los ciclos oscilatorios del potencial de campo local registrado en línea . De esta manera, el inicio del evento puede usarse como una señal de activación para un destello de luz que se guía de regreso al hipocampo para inhibir las neuronas específicamente durante las SWR y también para inhibir optogenéticamente la oscilación en sí. [126] Este tipo de experimentos de "circuito cerrado" son útiles para estudiar los complejos SWR y su papel en la memoria.

Biología celular / vías de señalización celular

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Control optogenético de fuerzas celulares e inducción de mecanotransducción. [127] Las células de la fotografía reciben una hora de imágenes simultáneamente con luz azul que pulsa cada 60 segundos. Esto también se indica cuando el punto azul parpadea en la imagen. La célula se relaja durante una hora sin activación de la luz y luego este ciclo se repite nuevamente. El recuadro cuadrado magnifica el núcleo de la célula.

De manera análoga a cómo los canales iónicos activados por luz natural, como la canalrodopsina-2, permiten el control óptico del flujo de iones, que es especialmente útil en neurociencia, las proteínas de transducción de señales controladas por luz natural también permiten el control óptico de las vías bioquímicas, incluida la generación de segundos mensajeros y interacciones proteína-proteína, que es especialmente útil en el estudio de la biología celular y del desarrollo. [128] En 2002, se demostró el primer ejemplo de uso de fotoproteínas de otro organismo para controlar una vía bioquímica utilizando la interacción inducida por la luz entre el fitocromo vegetal y el factor de interacción con el fitocromo (PIF) para controlar la transcripción de genes en levaduras. [3] Al fusionar el fitocromo con un dominio de unión al ADN y el PIF a un dominio de activación transcripcional, la luz podría inducir la activación transcripcional de genes reconocidos por el dominio de unión al ADN. [3] Este estudio anticipó aspectos del desarrollo posterior de la optogenética en el cerebro, por ejemplo, al sugerir que "la entrega de luz dirigida por fibra óptica tiene el potencial de apuntar a células o tejidos seleccionados, incluso dentro de organismos más grandes y más opacos". [3] La literatura ha sido inconsistente en cuanto a si el control de la bioquímica celular con fotoproteínas debe incluirse dentro de la definición de optogenética, ya que la optogenética en el uso común se refiere específicamente al control de la activación neuronal con opsinas, [5] [6] [7 ] [129] y como control de la activación neuronal con opsinas posdata y utiliza distintos mecanismos del control de la bioquímica celular con fotoproteínas. [128]

Proteínas fotosensibles utilizadas en diversas vías de señalización celular

Además de los fitocromos, que se encuentran en plantas y cianobacterias, los dominios LOV ( dominio sensor de voltaje de oxígeno de luz ) de plantas y dominios de levadura y criptocromo de plantas son otros dominios fotosensoriales naturales que se han utilizado para el control óptico de vías bioquímicas en células. [130] [128] Además, se ha diseñado un dominio fotosensorial sintético a partir de la proteína fluorescente Dronpa para el control óptico de las vías bioquímicas. [128] En los dominios fotosensoriales, la absorción de luz está acoplada a un cambio en las interacciones proteína-proteína (en el caso de fitocromos, algunos dominios LOV, criptocromos y mutantes de Dronpa) o un cambio conformacional que expone un segmento de proteína enlazado o altera el actividad de un dominio de proteína enlazado (en el caso de fitocromos y algunos dominios LOV). [128] Las interacciones proteína-proteína reguladas por luz se pueden utilizar para reclutar proteínas en el ADN, por ejemplo, para inducir la transcripción de genes o modificaciones del ADN, o en la membrana plasmática, por ejemplo, para activar proteínas de señalización residentes. [127] [131] [132] [133] [134] [135] CRY2 también se agrupa cuando está activo, por lo que se ha fusionado con dominios de señalización y posteriormente fotoactivado para permitir la activación basada en agrupamiento. [136] El dominio LOV2 de Avena sativa (avena común) se ha utilizado para exponer péptidos cortos o un dominio de proteína activa de una manera dependiente de la luz. [137] [138] [139] La introducción de este dominio LOV en otra proteína puede regular la función a través del trastorno peptídico inducido por la luz. [140] La proteína asLOV2, que expone optogenéticamente un péptido, también se ha utilizado como andamio para varios sistemas sintéticos de dimerización inducida por luz y disociación inducida por luz (iLID y LOVTRAP, respectivamente). [141] [142] Los sistemas se pueden usar para controlar proteínas a través de una estrategia de división de proteínas. [143] Los dominios de Dronpa fotodisociables también se han utilizado para enjaular un sitio activo de proteína en la oscuridad, desencajarlo después de la iluminación con luz cian y volver a enjaular después de la iluminación con luz violeta. [144]

Control temporal de la transducción de señales con luz

Se está explorando la capacidad de controlar ópticamente las señales durante varios períodos de tiempo para dilucidar cómo las vías de señalización celular convierten la duración de la señal y la respuesta a diferentes salidas. [82] Las cascadas de señalización natural son capaces de responder con diferentes salidas a las diferencias en la duración y la dinámica del tiempo de estímulo. [145] Por ejemplo, el tratamiento de células PC12 con factor de crecimiento epidérmico (EGF, que induce un perfil transitorio de actividad de ERK) conduce a la proliferación celular, mientras que la introducción del factor de crecimiento nervioso (NGF, que induce un perfil sostenido de actividad de ERK) conduce a la diferenciación en neuronas -como células. [146] Este comportamiento se caracterizó inicialmente mediante la aplicación EGF y NGF, pero el hallazgo se ha replicado parcialmente con entradas ópticas. [147] Además, se descubrió un ciclo de retroalimentación negativa rápida en la vía RAF-MEK-ERK utilizando la activación pulsátil de un RAF fotoconmutable diseñado con dominios Dronpa fotodisociables. [144]

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