Un ensayo clonogénico es una técnica de biología celular para estudiar la efectividad de agentes específicos sobre la supervivencia y proliferación de células. Se utiliza con frecuencia en los laboratorios de investigación del cáncer para determinar el efecto de los fármacos o la radiación sobre la proliferación de células tumorales [1] , así como para la titulación de partículas destructoras de células (CKP) en reservas de virus. [2] Fue desarrollado por primera vez por TT Puck y Philip I. Marcus en la Universidad de Colorado en 1955. [3]
Aunque esta técnica puede proporcionar resultados precisos, la configuración y el análisis del ensayo requiere mucho tiempo y solo puede proporcionar datos sobre células tumorales que pueden crecer en cultivo. La palabra "clonogénica" se refiere al hecho de que estas células son clones entre sí.
Procedimiento
El experimento consta de tres pasos principales:
- El tratamiento se aplica a una muestra de células.
- Las células se "colocan en placa" en un recipiente de cultivo de tejidos y se dejan crecer.
- Las colonias producidas se fijan, tiñen y cuentan.
Al final del experimento, se mide el porcentaje de células que sobrevivieron al tratamiento. Una representación gráfica de la supervivencia frente a la concentración de fármaco o la dosis de radiación ionizante se denomina curva de supervivencia celular . [4]
Para los ensayos de partículas destructoras de células, la fracción superviviente de células se usa para aproximar la distribución de Poisson de partículas de virus entre células y, por lo tanto, determinar el número de CKP encontradas por cada célula.
Se podría usar cualquier tipo de célula en un experimento, pero dado que el objetivo de estos experimentos en la investigación oncológica es el descubrimiento de tratamientos contra el cáncer más efectivos, las células tumorales humanas son una opción típica. Las células provienen de "líneas celulares" preparadas, que han sido bien estudiadas y cuyas características generales son conocidas, o de una biopsia de un tumor en un paciente. [5] Las células se colocan en placas de Petri o en placas que contienen varios "pocillos" circulares. Se siembra en placas un número particular de células dependiendo del experimento; para un experimento que implica irradiación, es habitual colocar en placa un mayor número de células con una dosis creciente de radiación. Por ejemplo, a una dosis de 0 o 1 gris de radiación, se pueden sembrar 500 células, pero a 4 o 5 grises, se pueden sembrar 2500, ya que un gran número de células mueren a este nivel de radiación y los efectos del un tratamiento específico sería inobservable.
El recuento de las colonias de células se suele realizar al microscopio y es bastante tedioso. Recientemente, se han desarrollado máquinas que utilizan algoritmos para analizar imágenes. [6] Estos son capturados por un escáner de imágenes o un microscopio automatizado que puede automatizar completamente el proceso de conteo. [7] Una de esas máquinas automatizadas funciona aceptando ciertos tipos de placas de celdas a través de una ranura (similar a un reproductor de CD), tomando una fotografía y subiéndola a una computadora para su análisis inmediato. Los recuentos confiables están disponibles en segundos.
Variables
El tratamiento suele ser un fármaco , radiación ionizante o una combinación de ambos. [8] Algunas investigaciones actuales estudian la potenciación de los efectos de los fármacos mediante la irradiación concurrente — un efecto sinérgico — y en esta situación se estudian dos grupos: un grupo de control, que no se trata con el fármaco; y un grupo de tratamiento, que se trata con el fármaco. Ambos grupos se irradian. Si las pendientes de sus curvas de supervivencia difieren significativamente, entonces un efecto potenciador puede ser evidente y podría estudiarse más a fondo. Dado que muchas células tumorales no desarrollan colonias en cultivo, el ensayo de proliferación celular, que según se informa tiene una precisión satisfactoria para medir los efectos sinérgicos entre la radiación ionizante y los fármacos, puede utilizarse como sustituto [9].
Una discusión exhaustiva de la investigación prometedora que se está llevando a cabo con la ayuda de esta técnica está más allá del alcance de este texto, pero algunos estudios involucran el efecto de la expresión de genes o receptores particulares en la célula, las respuestas de diferentes tipos de células o sinérgicas. efectos de múltiples fármacos.
Ver también
Referencias
- ^ Hoffman, Robert M. (1991). "Ensayos de sensibilidad in vitro en cáncer: revisión, análisis y pronóstico". Revista de análisis de laboratorio clínico . 5 (2): 133–43. doi : 10.1002 / jcla.1860050211 . PMID 2023059 .
- ^ Ngunjiri, JM; Sekellick, MJ; Marcus, PI (2008). "El ensayo clonogénico de virus de la influenza tipo a revela partículas no infecciosas que matan células (que inducen la apoptosis)" . Revista de Virología . 82 (6): 2673–80. doi : 10.1128 / JVI.02221-07 . PMC 2258965 . PMID 18184709 .
- ^ Transcripción de la entrevista TWiV @ http://www.twiv.tv/TWiV197-082612.pdf
- ^ Franken, Nicolaas AP; Rodermond, Hans M; Stap, Jan; Haveman, Jaap; Van Bree, Chris (2006). "Ensayo clonogénico de células in vitro" . Protocolos de la naturaleza . 1 (5): 2315–9. doi : 10.1038 / nprot.2006.339 . PMID 17406473 .
- ^ Hamburger, Anne W. (1987). "El ensayo clonogénico de tumores humanos como sistema modelo en biología celular". La Revista Internacional de Clonación Celular . 5 (2): 89–107. doi : 10.1002 / tallo.5530050202 .
- ^ Niyazi, Maximiliano; Niyazi, Ismat; Belka, Claus (2007). "Contando colonias de ensayos clonogénicos mediante el uso de software densitométrico" . Oncología Radioterápica . 2 : 4. doi : 10.1186 / 1748-717X-2-4 . PMC 1770926 . PMID 17212832 .
- ^ Dahle, Jostein; Kakar, Manish; Steen, Harald B .; Kaalhus, Olav (2004). "Recuento automatizado de colonias de células de mamíferos mediante un escáner de lecho plano y procesamiento de imágenes". Citometría . 60A (2): 182–8. doi : 10.1002 / cyto.a.20038 .
- ^ Carney, DN; Winkler, CF (1985). "Ensayos in vitro de sensibilidad quimioterapéutica". Avances importantes en oncología : 78-103. PMID 3916747 .
- ^ Liu, Q; Meng, W (2015). "Adaptación de una plataforma de detección de fármacos para descubrir asociaciones de radiosensibilizadores moleculares dirigidos con biomarcadores genómicos" . Investigación del cáncer molecular . 13 : 713–720. doi : 10.1158 / 1541-7786.MCR-14-0570 . PMC 4410013 . PMID 25667133 .