Hibridación genómica comparativa

La hibridación genómica comparativa (CGH) es un método citogenético molecular para analizar las variaciones del número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía en el ADN de una muestra de prueba en comparación con una muestra de referencia, sin la necesidad de cultivar células. El objetivo de esta técnica es comparar rápida y eficazmente dos muestras de ADN genómico que surgen de dos fuentes, que suelen estar estrechamente relacionadas, porque se sospecha que contienen diferencias en términos de ganancias o pérdidas de cromosomas completos o regiones subcromosómicas.(una porción de un cromosoma completo). Esta técnica se desarrolló originalmente para la evaluación de las diferencias entre los complementos cromosómicos del tumor sólido y el tejido normal, ^[1] y tiene una resolución mejorada de 5 a 10 megabases en comparación con las técnicas de análisis citogenético más tradicionales de bandas de giemsa y fluorescencia in situ. hibridación (FISH) que están limitados por la resolución del microscopio utilizado. ^{[2] [3]}

Esto se logra mediante el uso de hibridación in situ de fluorescencia competitiva. En resumen, esto implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a comparar, más comúnmente una fuente de prueba y de referencia, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con fluoróforos (moléculas fluorescentes) de diferentes colores (generalmente rojo y verde), desnaturalización de la ADN de modo que sea monocatenario, y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1: 1 con una propagación de cromosomas en metafase normal , a la que las muestras de ADN marcadas se unirán en su locusde origen. Usando un microscopio de fluorescencia y un software de computadora, las señales fluorescentes de color diferencial se comparan a lo largo de la longitud de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos fuentes. Una mayor intensidad del color de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material de esa región en la muestra fuente correspondiente, mientras que una intensidad más alta del color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de prueba en esa muestra específica. región. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluoróforo son rojas y verdes) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa ubicación. ^{[2] [3]}

CGH solo puede detectar anomalías cromosómicas desequilibradas . Esto se debe a que las anomalías cromosómicas equilibradas, como las translocaciones recíprocas , las inversiones o los cromosomas en anillo , no afectan el número de copias, que es lo que detectan las tecnologías CGH. Sin embargo, CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y el descubrimiento de deleciones y duplicaciones, incluso a escala microscópica, lo que puede conducir a la identificación de genes candidatos para ser explorados más a fondo mediante otras técnicas citológicas. ^[2]

Mediante el uso de micromatrices de ADN junto con técnicas CGH, se ha desarrollado la forma más específica de matriz CGH (aCGH), que permite una medida locus por locus de CNV con una resolución aumentada tan baja como 100 kilobases . ^{[4] [5]} Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de condiciones conocidas y desconocidas.

Historia

La motivación subyacente al desarrollo de CGH provino del hecho de que las formas disponibles de análisis citogenético en ese momento ( bandas de Giemsa y FISH ) estaban limitadas en su resolución potencial por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados que proporcionaban. Además, la interpretación de las bandas de Giemsa tiene el potencial de ser ambigua y, por lo tanto, ha reducido la confiabilidad, y ambas técnicas requieren una gran cantidad de mano de obra, lo que limita los loci que pueden examinarse. ^[4]

El primer informe del análisis CGH fue realizado por Kallioniemi y sus colegas en 1992 en la Universidad de California, San Francisco, quienes utilizaron CGH en el análisis de tumores sólidos. Lo lograron mediante la aplicación directa de la técnica tanto a las líneas celulares de cáncer de mama como a los tumores primarios de vejiga con el fin de establecer cariotipos de número de copias completo para las células. Pudieron identificar 16 regiones diferentes de amplificación, muchas de las cuales fueron descubrimientos novedosos. ^[1]

Poco después, en 1993, du Manoir et al. informó prácticamente la misma metodología. Los autores pintaron una serie de cromosomas humanos individuales de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes en diferentes proporciones para probar la técnica, y también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes afectados con síndrome de Downs o leucemia prolinfocítica de células T , así como células de una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que las proporciones de fluorescencia obtenidas eran precisas y que las diferencias entre el ADN genómico de diferentes tipos de células eran detectables y, por lo tanto, CGH era una herramienta de análisis citogenético de gran utilidad. ^[6]

Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH fue difícil, ya que los protocolos no eran uniformes y, por lo tanto, surgieron inconsistencias, especialmente debido a las incertidumbres en la interpretación de los datos. ^[3] Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión que describía un protocolo de fácil comprensión en detalle ^[7] y el software de análisis de imágenes se puso a disposición comercial, lo que permitió que CGH se utilizara en todo el mundo. ^[3] Como nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de la polimerasa cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR) estuvo disponible para la generación de productos de ADN, fue posible aplicar el concepto de CGH a anomalías cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, se mejoró la resolución de CGH. ^[3]

La aplicación de la matriz CGH, con lo que los microarrays de ADN se utilizan en lugar de la preparación tradicional de cromosoma en metafase, fue iniciada por Solinas-Tolodo et al. en 1997 utilizando células tumorales ^[8] y Pinkel et al. en 1998 mediante el uso de células de cáncer de mama. ^[9] Esto fue posible gracias al Proyecto Genoma Humano, que generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados con ubicaciones conocidas en todo el genoma humano , y estos fragmentos se utilizaron como sondas en la micromatriz de ADN. ^[10] Ahora sondas de diversos orígenes, como ADNc, productos de PCR genómica y cromosomas artificiales bacterianos.(BAC) se pueden utilizar en microarrays de ADN que pueden contener hasta 2 millones de sondas. ^[10] Array CGH está automatizado, permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que el CGH tradicional, ya que las sondas son mucho más pequeñas que las preparaciones en metafase, requieren cantidades más pequeñas de ADN, se pueden dirigir a regiones cromosómicas específicas si es necesario y se ordenan y, por lo tanto, más rápido de analizar, haciéndolo mucho más adaptable a los usos de diagnóstico. ^{[10] [11]}

Figura 1. Esquema del protocolo CGH

Metodos basicos

Preparación de portaobjetos en metafase

El ADN del portaobjetos es una muestra de referencia y, por lo tanto, se obtiene de un hombre o mujer cariotípicamente normal, aunque es preferible usar ADN femenino ya que poseen dos cromosomas X que contienen mucha más información genética que el cromosoma Y masculino. Se utilizan linfocitos de sangre periférica estimulados por fitohemaglutinina. 1 ml de sangre heparinizada se añade a 10 ml de medio de cultivo y se incubó durante 72 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ . Se añade colchicina para detener las células en la mitosis, luego se recogen las células y se tratan con cloruro de potasio hipotónico y se fijan en metanol / ácido acético 3: 1 . ^[3]

A continuación, se debe dejar caer una gota de la suspensión celular en un portaobjetos limpiado con etanol desde una distancia de aproximadamente 30 cm; de manera óptima, esto se debe realizar a temperatura ambiente con niveles de humedad del 60 al 70%. Los portaobjetos deben evaluarse mediante visualización utilizando un microscopio de contraste de fase, debe observarse un citoplasma mínimo y los cromosomas no deben superponerse y tener entre 400 y 550 bandas de largo sin cromátidas separadas y, finalmente, deben aparecer oscuros en lugar de brillantes. Luego, los portaobjetos deben secarse al aire durante la noche a temperatura ambiente, y cualquier almacenamiento adicional debe realizarse en grupos de cuatro a -20 ° C con perlas de sílice o nitrógeno.presente para mantener la sequedad. Deben probarse diferentes donantes ya que la hibridación puede ser variable. Se pueden usar portaobjetos disponibles comercialmente, pero siempre deben probarse primero. ^[3]

Aislamiento de ADN de tejido de prueba y tejido de referencia

La extracción estándar de fenol se utiliza para obtener ADN de tejido de prueba o de referencia (individuo cariotípicamente normal), que involucra la combinación de Tris - ácido etilendiaminotetraacético y fenol con ADN acuoso en cantidades iguales. A esto le sigue la separación por agitación y centrifugación, después de lo cual se retira la capa acuosa y se trata adicionalmente con éter y finalmente se utiliza precipitación con etanol para concentrar el ADN. ^[3]

Puede completarse utilizando kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente que se basan en columnas de afinidad . ^[3]

Preferiblemente, el ADN debe extraerse de tejido fresco o congelado, ya que será de la más alta calidad, aunque ahora es posible utilizar material de archivo fijado con formalina o incrustado en cera de parafina, siempre que se sigan los procedimientos adecuados. 0.5-1 μg de ADN es suficiente para el experimento CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada, se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN, sin embargo, en este caso es importante aplicar DOP-PCR tanto a la prueba como a la muestras de ADN de referencia para mejorar la fiabilidad. ^[3]

Etiquetado de ADN

La traducción de Nick se utiliza para marcar el ADN e implica cortar el ADN y sustituir los nucleótidos marcados con fluoróforos (marcaje directo) o biotina u oxigenina para que se agreguen anticuerpos conjugados con fluóforo más tarde (marcaje indirecto). Por tanto, es importante comprobar la longitud de los fragmentos del ADN de prueba y de referencia mediante electroforesis en gel , ya que deben estar dentro del rango de 500 kb-1500 kb para una hibridación óptima. ^[3]

Bloqueo

El ADN Cot-1 de Life Technologies Corporation no etiquetado (ADN placentario enriquecido con secuencias repetitivas de 50 pb-100 pb) se agrega para bloquear las secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en los centrómeros y telómeros , ya que estas secuencias, si se detectan, pueden reducir la proporción de fluorescencia y causar ganancias o pérdidas para escapar a la detección. ^[3]

Hibridación

Se mezclan 8-12 μl de cada prueba etiquetada y ADN de referencia etiquetado y se agregan 40 μg de ADN Cot-1, luego se precipita y luego se disuelve en 6 μl de mezcla de hibridación, que contiene 50% de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10% de sulfato de dextrano para aumentar la concentración eficaz de la sonda en una solución salina de citrato de sodio (SSC) a un pH de 7,0. ^[3]

La desnaturalización del portaobjetos y las sondas se realiza por separado. El portaobjetos se sumerge en formamida al 70% / 2xSSC durante 5 a 10 minutos a 72 ° C, mientras que las sondas se desnaturalizan por inmersión en un baño de agua a 80 ° C durante 10 minutos y se añaden inmediatamente a la preparación del portaobjetos en metafase. Esta reacción luego se cubre con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40 ° C. ^[3]

Luego se quita el cubreobjetos y se aplican lavados de 5 minutos, tres usando 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45 ° C con 0.1xSSC y uno usando TNT a temperatura ambiente. Después, la reacción se preincubó durante 10 minutos y luego se siguió de una incubación de 60 minutos a 37ºC, tres lavados más de 5 minutos con TNT y luego uno con 2xSSC a temperatura ambiente. A continuación, el portaobjetos se seca usando una serie de etanol al 70% / 96% / 100% antes de contratinción con DAPI (0,35 μg / ml), para la identificación de cromosomas, y sellando con un cubreobjetos. ^[3]

Visualización e imágenes de fluorescencia

Se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados para la tinción DAPI , así como los dos fluoróforos utilizados para la visualización, y estos filtros también deben minimizar la diafonía entre los fluoróforos, como los filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática , estar adecuadamente alineado y tener un objetivo de tipo "plano" que sea apocromático y dé un aumento de x63 o x100. ^[3]

La imagen debe grabarse utilizando una cámara con una resolución espacial de al menos 0,1 μm al nivel de la muestra y dar una imagen de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe poder integrar la imagen durante al menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits. ^[3]

El software CGH dedicado está disponible comercialmente para el paso de procesamiento de imágenes y es necesario para restar el ruido de fondo, eliminar y segmentar materiales que no sean de origen cromosómico, normalizar la proporción de fluorescencia, llevar a cabo el cariotipo interactivo y el escalado cromosómico a la longitud estándar. Un "cariotipo de número de copia relativo" que presenta áreas cromosómicas de deleciones o amplificaciones se genera promediando las proporciones de varias metafases de alta calidad y trazándolas a lo largo de un ideograma, un diagrama que identifica los cromosomas basado en patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de razón se realiza utilizando umbrales fijos o estadísticos ( intervalos de confianza). Cuando se utilizan intervalos de confianza, las ganancias o pérdidas se identifican cuando el 95% de la proporción de fluorescencia no contiene 1.0. ^[3]

Notas adicionales

Se debe tener mucho cuidado para evitar la contaminación de cualquier paso que involucre ADN, especialmente con el ADN de prueba, ya que la contaminación de la muestra con ADN normal sesgará los resultados más cerca de 1.0, por lo que las anomalías pueden pasar desapercibidas. Pueden emplearse experimentos de FISH, PCR y citometría de flujo para confirmar los resultados. ^{[4] [12]}

Matriz de hibridación genómica comparativa

La hibridación genómica comparativa de matrices (también hibridación genómica comparativa basada en micromatrices, CGH de matriz, CGH de matriz, aCGH) es una técnica citogenética molecular para la detección de cambios en el número de copias cromosómicas en un genoma amplio y en una escala de alta resolución. ^[13] Array CGH compara el genoma del paciente con un genoma de referencia e identifica diferencias entre los dos genomas y, por lo tanto, localiza regiones de desequilibrios genómicos en el paciente, utilizando los mismos principios de hibridación in situ de fluorescencia competitiva que el CGH tradicional.

Con la introducción de la matriz CGH, se supera la principal limitación de la CGH convencional, una resolución baja. En la matriz CGH, los cromosomas en metafase se reemplazan por fragmentos de ADN clonados (+ 100-200 kb) de los cuales se conoce la ubicación cromosómica exacta. Esto permite la detección de aberraciones con más detalle y, además, hace posible mapear los cambios directamente en la secuencia genómica. ^[14]

Array CGH ha demostrado ser una técnica específica, sensible, rápida y de alto rendimiento, con ventajas considerables en comparación con otros métodos utilizados para el análisis de cambios en el número de copias de ADN, lo que la hace más adecuada para aplicaciones de diagnóstico. Con este método, se pueden detectar cambios en el número de copias a un nivel de 5 a 10 kilobases de secuencias de ADN. ^[15] A partir de 2006 ^[actualizar], incluso los arreglos CGH de alta resolución ( HR-CGH ) son precisos para detectar variaciones estructurales (SV) a una resolución de 200 bp. ^[16] Este método permite identificar nuevos cambios cromosómicos recurrentes como microdeleciones y duplicaciones en condiciones humanas comocáncer y defectos de nacimiento debidos a aberraciones cromosómicas.

Figura 2. Protocolo Array-CGH

Metodología

Array CGH se basa en el mismo principio que el CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o control) y el ADN de una muestra de prueba (o paciente) se marcan diferencialmente con dos fluoróforos diferentes y se utilizan como sondas que se cohibridan competitivamente en dianas de ácido nucleico . En CGH convencional, el objetivo es una propagación en metafase de referencia. En la matriz CGH, estas dianas pueden ser fragmentos genómicos clonados en una variedad de vectores (tales como BAC o plásmidos ), ADNc u oligonucleótidos . ^[17]

La Figura 2. ^[14] es una descripción esquemática de la técnica de matriz CGH. El ADN de la muestra que se va a analizar se etiqueta con un fluoróforo rojo ( cianina 5) y una muestra de ADN de referencia se etiqueta con un fluoróforo verde (cianina 3). Se mezclan cantidades iguales de las dos muestras de ADN y se cohibridan en una micromatriz de ADN de varios miles de fragmentos de ADN u oligonucleótidos clonados uniformemente espaciados, que se han manchado por triplicado en la matriz. Después de la hibridación, se utilizan sistemas de imágenes digitales para capturar y cuantificar las intensidades relativas de fluorescencia de cada uno de los fluoróforos hibridados. ^[17]La relación resultante de las intensidades de fluorescencia es proporcional a la relación del número de copias de las secuencias de ADN en los genomas de prueba y de referencia. Si las intensidades de los flurocromos son iguales en una sonda, se interpreta que esta región del genoma del paciente tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de prueba y de referencia; si hay una relación Cy3: Cy5 alterada, esto indica una pérdida o una ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica. ^[18]

Enfoques tecnológicos para array CGH

Perfil de ACGH de la línea celular de neuroblastoma IMR32

Array CGH se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones de la matriz CGH dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizaron matrices producidas a partir de clones de ADN genómico de inserto grande, como los BAC . El uso de BAC proporciona señales de suficiente intensidad para detectar cambios de una sola copia y localizar con precisión los límites de aberración. Sin embargo, los rendimientos iniciales de ADN de los clones BAC aislados son bajos y son necesarias técnicas de amplificación de ADN. Estas técnicas incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligación , PCR de cebador degenerado usando uno o varios conjuntos de cebadores y amplificación por círculo rodante . ^[19]Las matrices también se pueden construir usando ADNc. Actualmente, estas matrices producen una alta resolución espacial, pero el número de ADNc está limitado por los genes que están codificados en los cromosomas y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. ^[14] Esto da como resultado la incapacidad de detectar cambios de una sola copia en una escala amplia del genoma. ^[20] El último enfoque es detectar las matrices con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligos es casi infinita y el procesamiento es rápido, rentable y fácil. Aunque los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad para detectar cambios de una sola copia, el promedio de las proporciones de los oligos que se mapean uno al lado del otro en el cromosoma puede compensar la sensibilidad reducida. ^[21] También es posible utilizar matrices que tienen sondas superpuestas para que se puedan descubrir puntos de interrupción específicos.

Enfoques de diseño

Hay dos enfoques para el diseño de microarrays para aplicaciones CGH: genoma completo y dirigido.

Las matrices de genoma completo están diseñadas para cubrir todo el genoma humano. A menudo incluyen clones que proporcionan una amplia cobertura en todo el genoma; y matrices que tienen una cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Las matrices de genoma completo se han construido principalmente para aplicaciones de investigación y han demostrado su valor excepcional en el descubrimiento de genes. También son muy valiosos para analizar el genoma en busca de ganancias y pérdidas de ADN con una resolución sin precedentes. ^[17]

Las matrices dirigidas están diseñadas para una región o regiones específicas del genoma con el fin de evaluar ese segmento objetivo. Puede diseñarse para estudiar un cromosoma o segmento cromosómico específico o para identificar y evaluar anomalías específicas en la dosificación del ADN en individuos con sospecha de síndromes de microdeleción o reordenamientos subteloméricos. El objetivo fundamental de una micromatriz dirigida en la práctica médica es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, el asesoramiento genético, el pronóstico y el tratamiento clínico de anomalías citogenéticas desequilibradas. ^[17]

Aplicaciones

Convencional

La CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan de forma recurrente en tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. ^[22] Este enfoque también se puede utilizar para estudiar las aberraciones cromosómicas en los genomas fetales y neonatales . Además, la CGH convencional se puede utilizar para detectar anomalías cromosómicas y se ha demostrado que es eficaz en el diagnóstico de anomalías complejas asociadas con trastornos genéticos humanos. ^[14]

En la investigación del cáncer

Los datos de CGH de varios estudios del mismo tipo de tumor muestran patrones consistentes de aberraciones genéticas no aleatorias. ^[23] Algunos de estos cambios parecen ser comunes a varios tipos de tumores malignos, mientras que otros son más específicos del tumor. Por ejemplo, las ganancias de las regiones cromosómicas lq, 3q y 8q, así como las pérdidas de 8p, 13q, 16q y 17p, son comunes a varios tipos de tumores, como cáncer de mama, ovario, próstata, riñón y vejiga (Figura. 3). Otras alteraciones, como las ganancias de 12p y Xp en el cáncer de testículo, la ganancia de 13q y la pérdida de 9q en el cáncer de vejiga, la pérdida de 14q en el cáncer de riñón y la pérdida de Xp en el cáncer de ovario son más específicas y podrían reflejar las fuerzas de selección únicas que operan durante el desarrollo del cáncer en diferentes órganos. . ^[23] Array CGH también se utiliza con frecuencia en la investigación y el diagnóstico de neoplasias malignas de células B, como la leucemia linfocítica crónica.

Aberraciones cromosómicas

Cri du Chat (CdC) es un síndrome causado por una deleción parcial del brazo corto del cromosoma 5. ^[24] Varios estudios han demostrado que la CGH convencional es adecuada para detectar la deleción, así como alteraciones cromosómicas más complejas. Por ejemplo, Levy et al. (2002) informaron de un bebé con un llanto de gato, el sello distintivo de CdC, pero con un cariotipo indistinto. El análisis CGH reveló una pérdida de material cromosómico de 5p15.3 confirmando el diagnóstico clínicamente. Estos resultados demuestran que la CGH convencional es una técnica fiable para detectar aberraciones estructurales y, en casos específicos, puede ser más eficaz para diagnosticar anomalías complejas. ^[24]

Matriz CGH

Las aplicaciones de Array CGH están dirigidas principalmente a detectar anomalías genómicas en el cáncer. Sin embargo, la matriz CGH también es adecuada para el análisis de aberraciones en el número de copias de ADN que causan trastornos genéticos humanos. ^[14] Es decir, la matriz CGH se emplea para descubrir deleciones, amplificaciones, puntos de corte y anomalías de la ploidía. El diagnóstico temprano es beneficioso para el paciente, ya que puede someterse a tratamientos y asesoramiento adecuados para mejorar su pronóstico. ^[10]

Anomalías genómicas en el cáncer

Las alteraciones y reordenamientos genéticos ocurren con frecuencia en el cáncer y contribuyen a su patogénesis. La detección de estas aberraciones por matriz CGH proporciona información sobre la ubicación de genes importantes del cáncer y puede tener uso clínico en el diagnóstico, la clasificación del cáncer y el pronóstico. ^[17] Sin embargo, no todas las pérdidas de material genético son patogénicas, ya que una parte del material de ADN se pierde fisiológicamente durante el reordenamiento de los subgenes de inmunoglobulina. En un estudio reciente, la matriz CGH se implementó para identificar regiones de aberración cromosómica ( variación en el número de copias ) en varios modelos de cáncer de mama en ratones, lo que lleva a la identificación de genes cooperantes durante la oncogénesis inducida por myc. ^[25]

Array CGH también puede aplicarse no solo al descubrimiento de anomalías cromosómicas en el cáncer, sino también al seguimiento de la progresión de los tumores. La diferenciación entre lesiones metastásicas y leves también es posible utilizando FISH una vez que las anomalías han sido identificadas por array CGH. ^{[5] [10]}

Aberraciones submicroscópicas

El síndrome de Prader-Willi (PWS) es una anomalía estructural paterna que afecta a 15q11-13, mientras que una aberración materna en la misma región causa el síndrome de Angelman (AS). En ambos síndromes, la mayoría de los casos (75%) son el resultado de una deleción de 3-5 Mb de la región crítica de PWS / AS. ^[26] Estas pequeñas aberraciones no se pueden detectar usando citogenética o CGH convencional, pero pueden detectarse fácilmente usando matriz CGH. Como prueba de principio, Vissers et al. (2003) construyeron una amplia gama de genomas con una resolución de 1 Mb para examinar a tres pacientes con síndromes de microdeleción confirmados por FISH conocidos, incluido uno con PWS. En los tres casos, las anomalías, que van de 1,5 a 2,9 Mb, se identificaron fácilmente. ^[27] Por lo tanto, se demostró que la matriz CGH es un enfoque específico y sensible en la detección de aberraciones submicroscópicas.

Cuando se utilizan micromatrices superpuestas, también es posible descubrir puntos de interrupción implicados en aberraciones cromosómicas.

Diagnóstico genético prenatal

Aunque todavía no es una técnica ampliamente empleada, el uso de array CGH como herramienta para el cribado genético preimplantacional se está convirtiendo en un concepto cada vez más popular. Tiene el potencial de detectar NVC y aneuploidía en óvulos, espermatozoides o embriones que pueden contribuir a que el embrión no pueda implantarse con éxito, a un aborto espontáneo o afecciones como el síndrome de Down (trisomía 21). Esto hace que array CGH sea una herramienta prometedora para reducir la incidencia de condiciones que alteran la vida y mejorar las tasas de éxito de los intentos de FIV . La técnica implica la amplificación del genoma completo de una sola célula que luego se utiliza en el método de matriz CGH. También se puede utilizar en parejas portadoras de translocaciones cromosómicas.como las translocaciones recíprocas equilibradas o las translocaciones robertsonianas, que tienen el potencial de causar desequilibrios cromosómicos en su descendencia. ^{[12] [28] [29]}

Limitaciones de CGH y array CGH

Una desventaja principal de la CGH convencional es su incapacidad para detectar aberraciones cromosómicas estructurales sin cambios en el número de copias , como mosaicismo , translocaciones cromosómicas equilibradas e inversiones . CGH también solo puede detectar ganancias y pérdidas en relación con el nivel de ploidía. ^[30] Además, las regiones cromosómicas con secuencias de ADN cortas y repetitivas son muy variables entre los individuos y pueden interferir con el análisis CGH. ^[14] Por lo tanto, las regiones de ADN repetitivo como centrómeros y telómeros deben bloquearse con ADN repetitivo no etiquetado (por ejemplo, ADN Cot1) y / o pueden omitirse del cribado. ^[31]Además, la resolución de CGH convencional es un problema práctico importante que limita sus aplicaciones clínicas. Aunque la CGH ha demostrado ser una técnica útil y confiable en la investigación y el diagnóstico tanto del cáncer como de los trastornos genéticos humanos, las aplicaciones solo involucran anomalías graves. Debido a la resolución limitada de los cromosomas en metafase, las aberraciones menores de 5 a 10 Mb no pueden detectarse usando CGH convencional. ^[23]Para la detección de tales anomalías, se requiere una técnica de alta resolución. Array CGH supera muchas de estas limitaciones. Array CGH se caracteriza por una alta resolución, su mayor ventaja con respecto al CGH convencional. La resolución estándar varía entre 1 y 5 Mb, pero se puede aumentar hasta aproximadamente 40 kb complementando la matriz con clones adicionales. Sin embargo, como en el CGH convencional, la principal desventaja del CGH de matriz es su incapacidad para detectar aberraciones que no dan como resultado cambios en el número de copias y tiene una capacidad limitada para detectar mosaicismo. ^[14]El nivel de mosaicismo que se puede detectar depende de la sensibilidad y resolución espacial de los clones. En la actualidad, los reordenamientos presentes en aproximadamente el 50% de las células es el límite de detección. Para la detección de tales anomalías, todavía se deben utilizar otras técnicas, como SKY (cariotipo espectral) o FISH. ^[32]

Ver también

• Citogenética
• Cariotipo virtual

Referencias

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enlaces externos

• Grandes rondas virtuales: "Diferenciación de tecnologías de microarrays e implicaciones clínicas relacionadas" por Arthur Beaudet, MD
• Repositorio arrayMap : colección de conjuntos de datos de matrices de genomas de cáncer continuamente expandidos, con visualización de datos agregados y por matriz (ca. 64.000 matrices, septiembre de 2014).
• El recurso Cancer Chromosomes del antiguo NCBI ha sido descontinuado.