El ADN tumoral circulante (ADNct) es ADN fragmentado derivado del tumor en el torrente sanguíneo que no está asociado con las células. El ctDNA no debe confundirse con el ADN libre de células (cfDNA), un término más amplio que describe el ADN que circula libremente en el torrente sanguíneo, pero que no es necesariamente de origen tumoral. Dado que el ctDNA puede reflejar todo el genoma del tumor , ha ganado terreno por su potencial utilidad clínica; Se pueden tomar " biopsias líquidas " en forma de extracciones de sangre en varios momentos para controlar la progresión del tumor a lo largo del régimen de tratamiento. [1]
El ctDNA se origina directamente en el tumor o en las células tumorales circulantes (CTC), [2] que describe células tumorales intactas y viables que se desprenden de los tumores primarios y entran al torrente sanguíneo o al sistema linfático . El mecanismo preciso de liberación de ctDNA no está claro. Los procesos biológicos que se postula que están implicados en la liberación de ctDNA incluyen apoptosis y necrosis de células moribundas o liberación activa de células tumorales viables. [3] [4] [5] [6] [7] Los estudios en humanos (pacientes sanos y con cáncer) [8] y ratones xenoinjertados [9] muestran que el tamaño del ADNcf fragmentado es predominantemente de 166 pb de longitud, lo que corresponde a la longitud de ADN envuelto alrededor de un nucleosoma más un enlazador. La fragmentación de esta longitud podría ser indicativa de fragmentación de ADN apoptótico , lo que sugiere que la apoptosis puede ser el método principal de liberación de ADNc. La fragmentación del cfDNA se altera en el plasma de los pacientes con cáncer. [10] [11]
En el tejido sano, los fagocitos infiltrantes son responsables de la eliminación de restos celulares apoptóticos o necróticos, que incluyen el ADNcf. [12] cfDNA en pacientes sanos sólo está presente en niveles bajos, pero se pueden detectar niveles más altos de ctDNA en pacientes con cáncer con el aumento de tamaño de los tumores. [13] Esto posiblemente se deba a una infiltración ineficaz de células inmunitarias en los sitios del tumor, lo que reduce la eliminación eficaz del ctDNA del torrente sanguíneo. [12] La comparación de mutaciones en ctDNA y DNA extraído de tumores primarios de los mismos pacientes reveló la presencia de cambios genéticos idénticos relevantes para el cáncer. [14] [15] Esto llevó a la posibilidad de utilizar ctDNA para la detección temprana del cáncer y el seguimiento del tratamiento. [dieciséis]
Métodos
Consideraciones preanalíticas
Cuando se recolecta sangre en tubos con EDTA y se almacena, los glóbulos blancos comienzan a lisarse y liberan ADN genómico de tipo salvaje en la muestra en cantidades típicamente muchas veces más altas que las que contiene el ADNct. [17] Esto hace que la detección de mutaciones u otras Los biomarcadores de ctDNA son más difíciles. [18] El uso de tubos de estabilización celular disponibles comercialmente puede prevenir o retrasar la lisis de los glóbulos blancos, reduciendo así el efecto de dilución del ctDNA. [19] Sherwood et al demostraron una detección superior de mutaciones de KRAS en muestras emparejadas recolectadas en tubos con EDTA K3 y Streck BCT. [19] Las ventajas de los tubos de estabilización celular se pueden realizar en situaciones en las que la sangre no puede procesarse a plasma inmediatamente.
Otros procedimientos también pueden reducir la cantidad de ADN de tipo salvaje "contaminante" y hacer que la detección del ADNct sea más factible: [19]
- Nunca congele una muestra de sangre antes de extraer el plasma para el análisis de ctDNA
- Procese la muestra en plasma en un plazo de 2 a 4 horas (si se recoge en un tubo con EDTA)
- Nunca use tubos heparinizados, la heparina inhibe la PCR imitando la estructura helicoidal del ADN
- Realice un paso de centrifugación doble (centrifugue la sangre para extraer el plasma, luego repita en el plasma para eliminar los residuos en el fondo del tubo) para eliminar más residuos celulares antes de la extracción de ADN.
- El plasma es mejor que el suero para la recuperación del ctDNA [20]
Extracción de ctDNA
El principal atractivo del análisis de ctDNA es que se extrae de forma no invasiva mediante la extracción de sangre. La adquisición de cfDNA o ctDNA típicamente requiere la recolección de aproximadamente 3 ml de sangre en tubos recubiertos con EDTA . El uso de EDTA es importante para reducir la coagulación de la sangre. Las fracciones de sangre de plasma y suero se pueden separar mediante un paso de centrifugación. Posteriormente se pueden extraer ctDNA o cfDNA de estas fracciones. Aunque el suero tiende a tener mayores niveles de cfDNA, esto se atribuye principalmente al ADN de los linfocitos. [21] Los niveles altos de ADNcc contaminante son subóptimos porque esto puede disminuir la sensibilidad de la detección de ADNct. Por tanto, la mayoría de los estudios utilizan plasma para el aislamiento del ctDNA. Luego, el plasma se procesa nuevamente por centrifugación para eliminar las células sanguíneas intactas residuales. El sobrenadante se utiliza para la extracción de ADN, que se puede realizar utilizando kits disponibles comercialmente.
Análisis de ctDNA
El análisis de ctDNA después de la extracción requiere el uso de varios métodos de secuenciación y amplificación. Estos métodos se pueden separar en dos grupos principales en función de si el objetivo es interrogar a todos los genes en un enfoque no dirigido o si el objetivo es monitorear genes y mutaciones específicos en un enfoque dirigido.
Enfoques no dirigidos
Puede ser necesario un enfoque de secuenciación del genoma completo o del exoma completo para descubrir nuevas mutaciones en el ADN tumoral mientras se monitorea la carga de enfermedad o se rastrea la resistencia a los medicamentos. [22] Los enfoques no dirigidos también son útiles en la investigación para observar la heterogeneidad de los tumores o para descubrir nuevos objetivos farmacológicos. Sin embargo, aunque los métodos no dirigidos pueden ser necesarios en ciertas aplicaciones, son más costosos y tienen una resolución más baja. Esto dificulta la detección de mutaciones raras o en situaciones en las que están presentes niveles bajos de ctDNA (como una enfermedad residual mínima). Además, puede haber problemas para distinguir entre el ADN de las células tumorales y el ADN de las células normales utilizando un enfoque de genoma completo.
La secuenciación del genoma completo o del exoma normalmente utiliza tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento . En cambio, limitar la secuenciación a todo el exoma puede disminuir el costo y aumentar la velocidad, pero a costa de perder información sobre mutaciones en las regiones reguladoras no codificantes del ADN. [23] Si bien el simple hecho de observar los polimorfismos de ADN a través de la secuenciación no diferencia el ADN de las células tumorales o normales, este problema se puede resolver comparando con una muestra de control de ADN normal (por ejemplo, ADN obtenido a través de un hisopo bucal ). La secuenciación del genoma y del exoma completo es útil para el descubrimiento inicial de la mutación. Esto proporciona información para el uso de técnicas dirigidas más sensibles, que luego se pueden utilizar con fines de seguimiento de enfermedades.
La secuenciación del genoma completo permite recuperar las propiedades estructurales del cfDNA, el tamaño de los fragmentos y sus patrones de fragmentación. Estos patrones únicos pueden ser una fuente importante de información para mejorar la detección de ctDNA o localizar el tejido de origen de estos fragmentos. [24] La selección del tamaño de fragmentos cortos (<150 pb) con métodos in vitro o in silico podría mejorar la recuperación de mutaciones y aberraciones en el número de copias. [25]
Cariotipo digital
Este método fue desarrollado originalmente por el laboratorio de Bert Vogelstein , Luis Díaz y Victor Velculescu en la Universidad Johns Hopkins . [26] A diferencia del cariotipo normal en el que se usa un tinte para teñir bandas cromosómicas con el fin de visualizar los cromosomas, el cariotipo digital usa secuencias de ADN de loci en todo el genoma para calcular la variación del número de copias . [26] Las variaciones en el número de copias son comunes en los cánceres y describen situaciones en las que la pérdida de heterocigosidad de un gen puede provocar una disminución de la función debido a una menor expresión o la duplicación de un gen, lo que conduce a una sobreexpresión.
Análisis personalizado de extremos reorganizados (PARE)
Después de secuenciar todo el genoma mediante un método de secuenciación de alto rendimiento, como Illumina HiSeq, se aplica PARE a los datos para analizar reordenamientos y translocaciones cromosómicas. Esta técnica se diseñó originalmente para analizar el ADN tumoral sólido, pero se modificó para aplicaciones de ADNct. [26]
Metilación e hidroximetilación del ADN
El marcado epigenético adecuado es esencial para la expresión génica normal y la función celular, y las alteraciones aberrantes en los patrones epigenéticos son un sello distintivo del cáncer. [27] Un estado epigenético normal se mantiene en una célula, al menos en parte, a través de la metilación del ADN . [28] La medición de patrones de metilación aberrantes en el ctDNA es posible debido a la metilación estable de regiones de ADN denominadas " islas CpG ". La metilación del ctDNA puede detectarse mediante tratamiento con bisulfito . El tratamiento con bisulfito convierte químicamente las citosinas no metiladas en uracilo y deja las citosinas metiladas sin modificar. Posteriormente, se secuencia el ADN y se puede identificar cualquier alteración en el patrón de metilación del ADN. La hidroximetilación del ADN es una marca asociada de manera similar que se ha demostrado que es un marcador predictivo de condiciones saludables frente a enfermedades en el ADNcf, incluido el cáncer. [29] [30] )
Enfoques dirigidos
En un enfoque dirigido, la secuenciación de ctDNA puede dirigirse hacia un panel genético construido basándose en puntos calientes mutacionales para el cáncer de interés. Esto es especialmente importante para informar sobre el tratamiento en situaciones en las que se identifican mutaciones en objetivos farmacológicos. [23] También es posible personalizar el análisis dirigido de ctDNA a cada paciente mediante la combinación de biopsias líquidas con biopsias de tejido primario estándar. La secuenciación del genoma completo o del exoma completo de la biopsia del tumor primario permite el descubrimiento de mutaciones genéticas específicas del tumor de un paciente y puede usarse para la secuenciación dirigida posterior del ctDNA del paciente. La mayor sensibilidad de la detección del ctDNA se logra mediante la secuenciación dirigida de polimorfismos de nucleótido único (SNP) específicos . Los genes comúnmente mutados, como los oncogenes, que típicamente tienen mutaciones en puntos calientes, son buenos candidatos para enfoques de secuenciación dirigida. Por el contrario, la mayoría de los genes supresores de tumores tienen una amplia gama de posibles mutaciones de pérdida de función en todo el gen y, como tales, no son adecuados para la secuenciación dirigida.
Los enfoques dirigidos tienen la ventaja de amplificar el ctDNA mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR digital . Esto es especialmente importante cuando se analiza el ctDNA no solo porque hay niveles relativamente bajos de DNA circulando en el torrente sanguíneo, sino también porque el ctDNA constituye una pequeña proporción del total de ADN libre de células extraído. [23] Por lo tanto, la amplificación de regiones de interés puede mejorar drásticamente la sensibilidad de la detección del ctDNA. Sin embargo, la amplificación mediante PCR puede introducir errores dada la tasa de error inherente de las ADN polimerasas. Los errores introducidos durante la secuenciación también pueden disminuir la sensibilidad de detectar mutaciones del ctDNA.
PCR digital de gotas (ddPCR)
Este método se deriva de la PCR digital, originalmente nombrada por el grupo de Bert Vogelstein en la Universidad Johns Hopkins . La PCR digital de gotas utiliza un generador de gotas para dividir piezas individuales de ADN en gotas usando una emulsión de aceite / agua. Luego, las reacciones en cadena de la polimerasa individuales ocurren en cada gota usando cebadores seleccionados contra regiones de ctDNA y avanza hasta el punto final. La presencia de las secuencias de interés se mide mediante sondas fluorescentes, que se unen a la región amplificada. El ddPCR permite una evaluación altamente cuantitativa de las frecuencias de alelos y mutantes en el ctDNA, pero está limitado por el número de sondas fluorescentes que se pueden usar en un ensayo (hasta 5). [31] La sensibilidad del ensayo puede variar según la cantidad de ADN analizada y es de alrededor de 1 en 10.000. [31]
Perlas, emulsificación, amplificación y magnetismo ( BEAMing )
Esta técnica se basa en Droplet Digital PCR para identificar mutaciones en ctDNA mediante citometría de flujo. [32] Una vez que se extrae el ctDNA de la sangre, se realiza una PCR con cebadores diseñados para apuntar a las regiones de interés. Estos cebadores también contienen secuencias de ADN específicas o etiquetas. El ADN amplificado se mezcla con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina y se emulsiona en gotitas. Los cebadores biotinilados diseñados para unirse a las etiquetas se utilizan para amplificar el ADN. La biotinilación permite que el ADN amplificado se una a las perlas magnéticas, que están recubiertas con estreptavidina. Una vez completada la PCR, las perlas unidas al ADN se separan utilizando un imán. A continuación, el ADN de las perlas se desnaturaliza y se deja hibridar con oligonucleótidos fluorescentes específicos para cada molde de ADN. Los complejos de perlas-ADN resultantes se analizan luego usando citometría de flujo. Esta técnica es capaz de capturar frecuencias de mutación y alelos debido al acoplamiento con ddPCR. Sin embargo, a diferencia de ddPCR, se puede interrogar un mayor número de secuencias de ADN debido a la flexibilidad de usar sondas unidas por fluorescencia. Otra ventaja de este sistema es que el ADN aislado también se puede utilizar para la secuenciación posterior. [33] La sensibilidad es de 1,6 en 10 4 a 4,3 en 10 5 . [31]
Perfiles personalizados de cáncer mediante secuenciación profunda (CAPP-Seq)
Este método fue descrito originalmente por los grupos de Ash Alizadeh y Maximilian Diehn en la Universidad de Stanford . Esta técnica utiliza sondas selectoras de oligonucleótidos biotinilados para apuntar a secuencias de ADN relevantes para la detección de ADNc. [34] Se utilizaron bases de datos de cáncer disponibles al público para construir una biblioteca de sondas contra mutaciones recurrentes en el cáncer mediante el cálculo de su índice de recurrencia. El protocolo se optimizó para los bajos niveles de ADN observados en la colección de ctDNA. Luego, el ADN aislado se somete a una secuenciación profunda para aumentar la sensibilidad. Esta técnica permite el interrogatorio de cientos de regiones de ADN. Se informa que la sensibilidad de detección de ctDNA de CAPP-Seq es de 2,5 moléculas en 1.000.000. [35]
Secuenciación profunda de AMplicon etiquetado (TAM-Seq)
TAM-Seq permite la secuenciación dirigida de genes completos para detectar mutaciones en el ctDNA. [36] Primero se realiza un paso de amplificación general utilizando cebadores que abarcan todo el gen de interés en secciones de 150-200 pb. Luego, se utiliza un sistema de microfluidos para conectar adaptadores con un identificador único a cada amplicón para amplificar aún más el ADN en reacciones singleplex paralelas. Se demostró que esta técnica identifica con éxito mutaciones dispersas en el gen supresor de tumores TP53 en pacientes con cáncer de ovario avanzado. La sensibilidad de esta técnica es de 1 en 50.
Secuenciación segura (Safe-Seq)
Este método fue descrito originalmente por Bert Vogelstein y su grupo en la Universidad Johns Hopkins . Safe-Seq disminuye la tasa de error de la secuenciación masivamente paralela para aumentar la sensibilidad a mutantes raros. [37] Esto lo logra mediante la adición de una secuencia de identificador único (UID) a cada plantilla de ADN. A continuación, el ADN se amplifica utilizando los UID añadidos y se secuencia. Todas las moléculas de ADN con el mismo UID (una familia de UID) deben tener la misma secuencia de ADN informada, ya que se amplificaron a partir de una molécula. Sin embargo, se pueden introducir mutaciones mediante amplificación o se pueden llamar asignaciones de bases incorrectas en los pasos de secuenciación y análisis. La presencia del UID permite separar estos errores de metodología de las verdaderas mutaciones del ctDNA. Una mutación se considera un "supermutante" si el 95% de las lecturas secuenciadas están de acuerdo. La sensibilidad de este enfoque es de 9 en 1 millón. [31]
Secuenciación dúplex
Este método es una mejora en los UID únicos agregados en la técnica Safe-Seq. [38] En la secuenciación dúplex, el ADN bicatenario aleatorizado actúa como etiquetas únicas y se adhiere a un espaciador invariante. Las etiquetas se unen a ambos extremos de un fragmento de ADN (etiquetas α y β), lo que da como resultado dos plantillas únicas para la PCR: una hebra con una etiqueta α en el extremo 5 'y una etiqueta β en el extremo 3' y la otra hebra con una etiqueta β en el extremo 5 'y una etiqueta α en el extremo 3'. Estos fragmentos de ADN se amplifican luego con cebadores contra las secuencias invariantes de las etiquetas. El ADN amplificado se secuencia y analiza. El ADN con los adaptadores dúplex se compara y las mutaciones solo se aceptan si existe consenso entre ambas cadenas. Este método tiene en cuenta tanto los errores de secuenciación como los errores de amplificación por PCR en etapa temprana. La sensibilidad del enfoque para descubrir mutantes es de 1 en 10 ^ 7.
Supresión digital de errores integrada (iDES)-CAPP-Seq mejorado
iDES mejora el análisis CAPP-Seq de ctDNA para disminuir el error y, por lo tanto, aumentar la sensibilidad de detección. [35] Informado en 2016, iDES combina CAPP-Seq con tecnología de secuenciación de códigos de barras dúplex y con un algoritmo computacional que elimina los errores estereotipados asociados con el paso de hibridación CAPP-Seq. El método también integra la secuenciación dúplex siempre que sea posible e incluye métodos para una recuperación dúplex más eficiente a partir de ADN libre de células. La sensibilidad de esta versión mejorada de CAPP-Seq es de 4 en 100.000 copias.
Consideraciones
Detección de ADN "normal" frente a tumor
Uno de los desafíos en el uso de ctDNA como biomarcador de cáncer es si el ctDNA se puede distinguir con cfDNA de las células normales. El cfDNA es liberado por células no malignas durante el recambio celular normal, pero también durante procedimientos como cirugía , radioterapia o quimioterapia . Se cree que los leucocitos son los principales contribuyentes al ADNcf en suero. [23]
Investigar
ctDNA en la detección del cáncer
La utilidad clínica del ctDNA para la detección de enfermedades primarias está limitada en parte por la sensibilidad de la tecnología actual para detectar pequeños tumores con niveles bajos de ctDNA presentes y mutaciones somáticas desconocidas a priori. [13] [31]
ctDNA en la monitorización del cáncer
Es posible que no haya evidencia de enfermedad por métodos de imagen tradicionales, como CT , PET o MRI después de la resección del tumor. Por lo tanto, el análisis de ctDNA plantea una vía potencial para detectar la enfermedad residual mínima (ERM) y, por lo tanto, la posibilidad de recurrencia del tumor, en los casos en que los tumores en masa no están presentes mediante los métodos de imagen convencionales. [13] Anteriormente se había realizado una comparación de la detección de ERM mediante imágenes de TC con el ADNct en personas con cáncer de colon en estadio II; En este estudio, los investigadores pudieron detectar ctDNA en individuos que no mostraban signos de malignidad clínica mediante una tomografía computarizada, lo que sugiere que la detección de ctDNA tiene una mayor sensibilidad para evaluar MRD. [23] Sin embargo, los autores reconocen que el análisis del ctDNA no está exento de limitaciones; Las muestras de plasma recolectadas en el postoperatorio solo pudieron predecir la recurrencia a los 36 meses en el 48% de los casos. [23]
ctDNA como biomarcador pronóstico
La cuestión de si la medición de la cantidad o las cualidades del ctDNA podría usarse para determinar los resultados en personas con cáncer ha sido un tema de estudio. A partir de 2015, esto era muy incierto. [39] Aunque algunos estudios han mostrado una tendencia a niveles más altos de ctDNA en personas con cáncer metastásico en estadio alto, la carga de ctDNA no siempre se correlaciona con la estadificación tradicional del cáncer. [31] A partir de 2013, parecía poco probable que el ctDNA fuera de utilidad clínica como único predictor del pronóstico. [40]
Investigación sobre el cáncer
La aparición de tumores resistentes a los fármacos debido a la heterogeneidad intratumoral e inter tumoral es un problema en la eficacia del tratamiento. Un clon genético menor dentro del tumor puede expandirse después del tratamiento si porta una mutación resistente a los medicamentos. Las biopsias iniciales pueden pasar por alto estos clones debido a la baja frecuencia o la separación espacial de las células dentro del tumor. Por ejemplo, dado que una biopsia solo toma muestras de una pequeña parte del tumor, los clones que residen en una ubicación diferente pueden pasar desapercibidos. Esto puede inducir a error a la investigación que se centra en estudiar el papel de la heterogeneidad del tumor en la progresión y la recaída del cáncer. El uso de ctDNA en la investigación puede aliviar estas preocupaciones porque podría proporcionar una "captura de pantalla" más representativa de la diversidad genética del cáncer tanto en sitios primarios como metastásicos. Por ejemplo, se ha demostrado que el ctDNA es útil para estudiar la evolución clonal del cáncer de un paciente antes y después de los regímenes de tratamiento. [41] La detección temprana del cáncer sigue siendo un desafío, pero los avances recientes en el análisis de las características epigenéticas del ADNcf, o el desbloqueo del patrón de fragmentación mejoran la sensibilidad de la biopsia líquida. [42]
Desafíos para la implementación
La implementación del ctDNA en la práctica clínica se ve obstaculizada en gran medida por la falta de métodos estandarizados para el procesamiento y análisis del ctDNA. Se debe establecer la estandarización de los métodos para la recolección de muestras (incluido el tiempo de recolección), el procesamiento posterior (extracción y amplificación del ADN), la cuantificación y la validación antes de que el análisis del ADNct pueda convertirse en un ensayo clínico de rutina. Además, la creación de un panel de biomarcadores asociados a tumores "estándar" puede ser necesaria dada la resolución de los métodos actuales de detección y secuenciación del ctDNA. La secuenciación de aberraciones específicas de tumores a partir de muestras de plasma también puede ayudar a excluir del análisis el ADNcf contaminante; Los niveles elevados de cfDNA de células normales pueden atribuirse a causas no relacionadas con el cáncer. [23]
Ver también
- ADN mitocondrial circulante
- Biopsia líquida
Referencias
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Otras lecturas
- Aplicación de la metilación del ADN tumoral circulante en el diagnóstico de cáncer de pulmón Mayo de 2019
- ADN tumoral circulante: una nueva generación de biomarcadores del cáncer, febrero de 2014
- La 'biopsia líquida' de ADNc podría revolucionar la atención del cáncer noviembre de 2014
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