Los didesoxinucleótidos son inhibidores de la ADN polimerasa que alargan la cadena y se utilizan en el método Sanger para la secuenciación del ADN . [1] También se conocen como 2 ', 3' porque las posiciones 2 'y 3' de la ribosa carecen de grupos hidroxilo y se abrevian como ddNTPs (ddGTP, ddATP, ddTTP y ddCTP). [2]
Papel en el método Sanger
El Método Sanger se utiliza para amplificar un segmento diana de ADN, de modo que la secuencia de ADN se pueda determinar con precisión. La incorporación de ddNTP en las válvulas de reacción se usa simplemente para terminar la síntesis de una cadena de ADN en crecimiento, lo que da como resultado fragmentos de ADN parcialmente replicados. Esto se debe a que la ADN polimerasa requiere el grupo 3 'OH de la cadena en crecimiento y el grupo 5' fosfato del dNTP entrante para crear un enlace fosfodiéster . [2] A veces, la ADN polimerasa incorporará un ddNTP y la ausencia del grupo 3 'OH interrumpirá la reacción de condensación entre el fosfato 5' (después de la escisión del pirofosfato ) del nucleótido entrante con el grupo hidroxilo 3 'del anterior. nucleótido en la hebra en crecimiento. Esta reacción de condensación se produciría normalmente con la incorporación de un dNTP no modificado por la ADN polimerasa. En los términos más simples, el ataque nucleofílico del grupo 3 'OH lleva a la adición de un nucleótido a una cadena en crecimiento. La ausencia del grupo hidroxilo 3 'inhibe este ataque nucleofílico, lo que inhabilita la capacidad de las ADN polimerasas para continuar con su función. [2]
Este descubrimiento llevó a su nombre apropiado "nucleótidos terminales de cadena". [2] Los didesoxirribonucleótidos no tienen un grupo hidroxilo 3 ', por lo que no puede ocurrir más elongación de la cadena una vez que este didesoxinucleótido está en la cadena. Esto puede provocar la terminación de la secuencia de ADN. Por lo tanto, estas moléculas forman la base del método de secuenciación de ADN de terminación de cadena didesoxi , que fue informado por Frederick Sanger y su equipo en 1977 [3] como una extensión de un trabajo anterior. [4] El enfoque de Sanger se describió en 2001 como uno de los dos métodos fundamentales para secuenciar fragmentos de ADN [1] (el otro es el método de Maxam-Gilbert [5] ), pero el método de Sanger es "el más utilizado y el método utilizado por la mayoría de secuenciadores de ADN automatizados ". [1] Sanger ganó su segundo Premio Nobel de Química en 1980, compartiéndolo con Walter Gilbert ("por sus contribuciones sobre la determinación de secuencias de bases en ácidos nucleicos") y con Paul Berg ("por sus estudios fundamentales de la bioquímica de nucleicos ácidos, con especial atención al ADN recombinante "), [6] y discutió el uso de didesoxinucleótidos en su conferencia Nobel. [7]
Secuencia ADN
Los didesoxinucleótidos son útiles en la secuenciación de ADN en combinación con electroforesis . Una muestra de ADN que se somete a PCR ( reacción en cadena de la polimerasa ) en una mezcla que contiene los cuatro desoxinucleótidos y un didesoxinucleótido producirá hebras de longitud igual a la posición de cada base del tipo que complementa el tipo que tiene un didesoxinucleótido presente. La taq polimerasa utilizada en la PCR favorece al ddGNTP, que ha sido un patrón observado en diversas investigaciones. [8] Es decir, cada base de nucleótidos de ese tipo particular tiene la probabilidad de estar unida no a un desoxinucleótido sino a un didesoxinucleótido, que termina con el alargamiento de la cadena. Por lo tanto, si la muestra luego se somete a electroforesis, habrá una banda presente para cada longitud en la que esté presente el complemento del didesoxinucleótido. Ahora es común usar didesoxinucleótidos fluorescentes de manera que cada uno de los cuatro tenga una fluorescencia diferente que pueda ser detectada por un secuenciador; por tanto, sólo se necesita una reacción.
Referencias
- ↑ a b c Meis RJ, Raghavachari R (2001). "Aplicaciones del infrarrojo cercano en secuenciación y análisis de ADN" . En Raghavachari R (ed.). Aplicaciones del infrarrojo cercano en biotecnología . Prensa CRC . págs. 133–150. ISBN 9781420030242.
- ^ a b c d Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R (2014). Biología molecular del gen (7ª ed.). Cold Spring Harbor, Nueva York: Pearson. págs. 160-161. ISBN 978-0-321-76243-6.
- ^ Sanger F , Nicklen S, Coulson AR (diciembre de 1977). "Secuenciación de ADN con inhibidores de terminación de cadena" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 74 (12): 5463–7. Código bibliográfico : 1977PNAS ... 74.5463S . doi : 10.1073 / pnas.74.12.5463 . PMC 431765 . PMID 271968 .
- ^ Sanger F , Coulson AR (mayo de 1975). "Un método rápido para la determinación de secuencias de ADN mediante síntesis cebada con ADN polimerasa". Revista de Biología Molecular . 94 (3): 441–8. doi : 10.1016 / 0022-2836 (75) 90213-2 . PMID 1100841 .
- ^ Maxam AM , Gilbert W (febrero de 1977). "Un nuevo método para secuenciar el ADN" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 74 (2): 560–4. Código bibliográfico : 1977PNAS ... 74..560M . doi : 10.1073 / pnas.74.2.560 . PMC 392330 . PMID 265521 .
- ^ Kungliga Vetenskapsakademien (Real Academia Sueca de Ciencias) (14 de octubre de 1980). "El Premio Nobel de Química 1980" . nobelprize.org (Comunicado de prensa). Nobel Media . Archivado desde el original el 31 de octubre de 2018 . Consultado el 14 de diciembre de 2019 .
- ^ Sanger, F. (8 de diciembre de 1980). "Determinación de secuencias de nucleótidos en el ADN (conferencia Nobel)" (PDF) . nobelprize.org . Nobel Media . Archivado (PDF) desde el original el 14 de diciembre de 2019 . Consultado el 14 de diciembre de 2019 .
- ^ Li Y, Mitaxov V, Waksman G (agosto de 1999). "Diseño basado en la estructura de las polimerasas de ADN Taq con propiedades mejoradas de incorporación de didesoxinucleótidos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 96 (17): 9491–6. Código Bibliográfico : 1999PNAS ... 96.9491L . doi : 10.1073 / pnas.96.17.9491 . PMC 22236 . PMID 10449720 .
enlaces externos
- Medios relacionados con el didesoxinucleótido en Wikimedia Commons