En genética , el ADN complementario ( ADNc ) es ADN sintetizado a partir de una plantilla de ARN monocatenario (p. Ej., ARN mensajero ( ARNm ) o microARN (miARN)) en una reacción catalizada por la enzima transcriptasa inversa . El ADNc se usa a menudo para clonar genes eucariotas en procariotas . Cuando los científicos quieren expresar una proteína específica en una célula que normalmente no expresa esa proteína (es decir, heterólogaexpresión), transferirán el cDNA que codifica la proteína a la célula receptora. En biología molecular, el cDNA también se genera para analizar perfiles transcriptómicos en tejido a granel, células individuales o núcleos únicos en ensayos como microarrays y RNA-seq .
El ADNc también es producido naturalmente por retrovirus (como VIH-1 , VIH-2 , virus de inmunodeficiencia de simios , etc.) y luego se integra en el genoma del huésped, donde crea un provirus . [1]
El término ADNc también se usa, típicamente en un contexto bioinformático , para referirse a una secuencia de transcripción de ARNm, expresada como bases de ADN (desoxi-GCAT) en lugar de bases de ARN (GCAU).
Síntesis
El ARN sirve como molde para la síntesis de ADNc. [2] En la vida celular, el ADNc es generado por virus y retrotransposones para la integración del ARN en el ADN genómico diana . En biología molecular, el ARN se purifica del material de origen después de eliminar el ADN genómico, las proteínas y otros componentes celulares. Luego, el ADNc se sintetiza mediante transcripción inversa in vitro . [3]
Purificación de ARN
El ARN se transcribe a partir del ADN genómico en las células huésped y se extrae primero lisando las células y luego purificando el ARN utilizando métodos ampliamente utilizados como fenol-cloroformo, columna de sílice y métodos de extracción de ARN basados en perlas. [4] Los métodos de extracción varían según el material de origen. Por ejemplo, la extracción de ARN de tejido vegetal requiere reactivos adicionales, como polivinilpirrolidona (PVP), para eliminar compuestos fenólicos, carbohidratos y otros compuestos que, de otro modo, inutilizarían el ARN. [5] Para eliminar el ADN y las proteínas, se utilizan enzimas como DNasa y Proteinasa K para la degradación. [6] Es importante destacar que la integridad del ARN se mantiene inactivando las ARNasas con agentes caotrópicos como el isotiocianato de guanidinio, el dodecilsulfato de sodio (SDS), el fenol o el cloroformo. Luego, el ARN total se separa de otros componentes celulares y se precipita con alcohol. Existen varios kits comerciales para extracciones de ARN simples y rápidas para aplicaciones específicas. [7] Pueden usarse métodos adicionales basados en perlas para aislar subtipos específicos de ARN (por ejemplo, ARNm y microARN ) según el tamaño o las regiones de ARN únicas. [8] [9]
Transcripción inversa
Síntesis de la primera hebra
Usando una enzima de transcriptasa inversa y moldes de ARN purificado, se produce una hebra de ADNc (síntesis de la primera cadena de ADNc). La transcriptasa inversa M-MLV del virus de la leucemia murina de Moloney se usa comúnmente debido a su actividad reducida de RNasa H adecuada para la transcripción de ARN más largos. [10] La transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar también puede usarse para moldes de ARN con estructuras secundarias fuertes (es decir, alta temperatura de fusión). [11] El cDNA se genera comúnmente a partir de mRNA para análisis de expresión génica como RT-qPCR y RNA-seq . [12] El ARNm se transcribe de forma inversa selectivamente usando cebadores oligo-d T que son el complemento inverso de la cola poli-adenilada en el extremo 3 'de todo el ARNm. Una mezcla optimizada de cebadores de oligo-dT y hexámeros aleatorios aumenta la posibilidad de obtener ADNc de longitud completa al tiempo que reduce el sesgo 5 'o 3'. [13] El ARN ribosómico también puede agotarse para enriquecer tanto el ARNm como los transcritos no poli-adenilados, como algunos ARN no codificantes . [14]
Síntesis de segunda hebra
El resultado de la síntesis de la primera hebra, los híbridos de ARN-ADN, puede procesarse mediante múltiples métodos de síntesis de la segunda hebra o procesarse directamente en ensayos posteriores. [15] [16] Un método temprano conocido como síntesis preparada en horquilla se basaba en la formación de horquilla en el extremo 3 'del cDNA de la primera hebra para cebar la síntesis de la segunda hebra. Sin embargo, el cebado es aleatorio y la hidrólisis en horquilla conduce a la pérdida de información. El procedimiento de Gubler y Hoffman utiliza E. Coli RNase H para cortar el mRNA que se reemplaza con E. Coli DNA Polymerase I y se sella con E. Coli DNA Ligase . Una optimización de este procedimiento se basa en la baja actividad de ARNasa H de M-MLV para mellar el ARNm y el ARN restante se elimina más tarde mediante la adición de ARNasa H después de la traducción de la ADN polimerasa del ADNc de la segunda hebra. Esto evita la pérdida de información de la secuencia en el extremo 5 'del ARNm.
Aplicaciones
El ADN complementario se usa a menudo en la clonación de genes o como sondas de genes o en la creación de una biblioteca de ADNc . Cuando los científicos transfieren un gen de una célula a otra para expresar el nuevo material genético como una proteína en la célula receptora, el ADNc se agregará al receptor (en lugar del gen completo), porque el ADN de un gen completo puede incluir ADN que no codifica la proteína o que interrumpe la secuencia codificante de la proteína (p. ej., intrones ). Las secuencias parciales de ADNc se obtienen a menudo como etiquetas de secuencia expresadas .
Con la amplificación de secuencias de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ahora común, normalmente se realizará la transcripción inversa como paso inicial, seguida de PCR para obtener una secuencia exacta de ADNc para la expresión intracelular. Esto se logra diseñando cebadores de ADN específicos de secuencia que se hibridan con los extremos 5 'y 3' de una región de ADNc que codifica una proteína. Una vez amplificada, la secuencia puede cortarse en cada extremo con nucleasas e insertarse en una de las muchas secuencias pequeñas de ADN circular conocidas como vectores de expresión. Dichos vectores permiten la autorreplicación, dentro de las células, y potencialmente la integración en el ADN del huésped. Por lo general, también contienen un promotor fuerte para impulsar la transcripción del ADNc diana en ARNm, que luego se traduce en proteína.
El 13 de junio de 2013, la Corte Suprema de los Estados Unidos dictaminó en el caso de Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics que, si bien los genes humanos naturales no pueden patentarse , el cDNA es elegible para patente porque no se produce de forma natural. [17]
El cDNA también se utiliza para estudiar la expresión génica mediante métodos como RNA-seq o RT-qPCR . [18] [19] [20] Para la secuenciación, el ARN debe estar fragmentado debido a las limitaciones de tamaño de la plataforma de secuenciación. Además, el ADNc sintetizado de segunda hebra debe ligarse con adaptadores que permitan que los fragmentos de ADNc se amplifiquen por PCR y se unan a las células de flujo de secuenciación. Los métodos de análisis de genes específicos suelen utilizar microarrays y RT-qPCR para cuantificar los niveles de ADNc mediante métodos fluorométricos y de otro tipo.
Virus y retrotransposones
Algunos virus también usan ADNc para convertir su ARN viral en ARNm (ARN viral → ADNc → ARNm). El ARNm se utiliza para producir proteínas virales que se apoderen de la célula huésped.
Un ejemplo de este primer paso del ADN viral al ADNc puede verse en el ciclo de infección del VIH. Aquí, la membrana de la célula huésped se adhiere a la envoltura lipídica del virus, lo que permite que la cápside viral con dos copias del ARN del genoma viral ingrese al huésped. La copia del cDNA luego se realiza mediante la transcripción inversa del RNA viral, un proceso facilitado por la chaperona CypA y una transcriptasa inversa asociada a la cápside viral. [21]
El ADNc también se genera mediante retrotransposones en genomas eucariotas. Los retrotransposones son elementos genéticos móviles que se mueven dentro y, a veces, entre los genomas a través de intermedios de ARN. Este mecanismo se comparte con los virus con la exclusión de la generación de partículas infecciosas. [22] [23]
Ver también
- biblioteca de ADNc
- micromatriz de ADNc
- RNA-Seq
- RT-qPCR
Referencias
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enlaces externos
- Base de datos H-Invitational
- Anotación funcional de la base de datos del mouse
- Herramienta de ADN complementaria