El mapeo de epítopos es el proceso de identificar experimentalmente el sitio de unión, o "epítopo ", de un anticuerpo en su antígeno diana (generalmente, en una proteína). [1] [2] [3] La identificación y caracterización de los sitios de unión de anticuerpos ayudan en el descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias , vacunas y diagnósticos . [4] [5] [6] [7] [8] La caracterización de epítopos también puede ayudar a dilucidar el mecanismo de unión de un anticuerpo [9] y puede fortalecer la protección de la propiedad intelectual (patente). [10] [11][12] Los datos de mapeo de epítopos experimentales se pueden incorporar en algoritmos robustos para facilitar lapredicción in silico de epítopos de células B basados en secuencia y / o datos estructurales. [13] Los epítopos se dividen generalmente en tres clases: lineales, conformacionales y discontinuos. Los epítopos lineales están formados por una secuencia continua de aminoácidos en una proteína . En los epítopos conformacionales, los residuos de unión están contenidos dentro de ciertas conformaciones estructurales de proteínas clave, como en hélices, bucles o láminas beta. La conformación del epítopo es importante para llevar los residuos de unión a las posiciones correctas. Finalmente, los epítopos discontinuos consisten en partes del antígeno que no están próximas en la secuencia de la proteína, pero que se unen mediante un plegamiento de proteínas tridimensional. Los epítopos discontinuos pueden albergar partes lineales y conformacionales. Los estudios de mapeo de epítopos de células B sugieren que la mayoría de las interacciones entre antígenos y anticuerpos, particularmente autoanticuerpos y anticuerpos protectores (p. Ej., En vacunas), se basan en la unión a epítopos discontinuos.
Importancia para la caracterización de anticuerpos
Al proporcionar información sobre el mecanismo de acción , el mapeo de epítopos es un componente crítico en el desarrollo de anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAb). El mapeo de epítopos puede revelar cómo un mAb ejerce sus efectos funcionales, por ejemplo, bloqueando la unión de un ligando o atrapando una proteína en un estado no funcional. Muchos mAb terapéuticos se dirigen a epítopos conformacionales que solo están presentes cuando la proteína está en su estado nativo (correctamente plegado), lo que puede dificultar el mapeo de epítopos. [14] El mapeo de epítopos ha sido crucial para el desarrollo de vacunas contra patógenos virales prevalentes o mortales, como chikungunya , [15] dengue , [16] Ébola , [5] [17] [18] y virus Zika , [19] determinando los elementos antigénicos (epítopos) que confieren efectos de inmunización de larga duración. [20]
Los antígenos diana complejos, como las proteínas de membrana (p. Ej., Receptores acoplados a proteína G [GPCR] ) [21] y las proteínas de múltiples subunidades (p. Ej., Canales iónicos ) son dianas clave del descubrimiento de fármacos. El mapeo de epítopos en estos objetivos puede ser un desafío debido a la dificultad para expresar y purificar estas proteínas complejas. Las proteínas de membrana con frecuencia tienen regiones antigénicas cortas (epítopos) que se pliegan correctamente solo cuando están en el contexto de una bicapa lipídica. Como resultado, los epítopos de mAb en estas proteínas de membrana son a menudo conformacionales y, por lo tanto, son más difíciles de mapear. [14] [21]
Importancia para la protección de la propiedad intelectual (PI)
El mapeo de epítopos se ha vuelto frecuente en la protección de la propiedad intelectual (IP) de mAbs terapéuticos. El conocimiento de los sitios de unión específicos de los anticuerpos fortalece las patentes y las presentaciones reglamentarias al distinguir entre anticuerpos de la técnica actual y de la técnica anterior (existente). [10] [11] [22] La capacidad de diferenciar entre anticuerpos es particularmente importante cuando se patentan anticuerpos contra dianas terapéuticas bien validadas (p. Ej., PD1 y CD20 ) que pueden ser administradas por múltiples anticuerpos competidores. [23] Además de verificar la patentabilidad de los anticuerpos, se han utilizado datos de mapeo de epítopos para respaldar las afirmaciones generales de anticuerpos presentadas a la Oficina de Marcas y Patentes de los Estados Unidos . [11] [12]
Los datos de los epítopos han sido fundamentales para varios casos legales de alto perfil que involucran disputas sobre las regiones proteicas específicas objetivo de los anticuerpos terapéuticos. [22] A este respecto, el caso del inhibidor de PCSK9 de Amgen v. Sanofi / Regeneron Pharmaceuticals dependía de la capacidad de demostrar que los anticuerpos terapéuticos de Amgen y Sanofi / Regeneron se unían a aminoácidos superpuestos en la superficie de PCSK9 . [24]
Métodos
Hay varios métodos disponibles para mapear epítopos de anticuerpos en antígenos diana:
- Cocristalografía de rayos X y microscopía electrónica criogénica (cryo-EM) . La cocristalografía de rayos X se ha considerado históricamente como el método de referencia para el mapeo de epítopos porque permite la visualización directa de la interacción entre el antígeno y el anticuerpo. De manera similar, Cryo-EM puede proporcionar mapas de alta resolución de interacciones anticuerpo-antígeno. [25] Sin embargo, ambos enfoques son técnicamente desafiantes, requieren mucho tiempo y son costosos, y no todas las proteínas son susceptibles de cristalización. Además, estas técnicas no siempre son factibles debido a la dificultad de obtener cantidades suficientes de proteína correctamente plegada y procesada. Por último, ninguna técnica puede distinguir los residuos de epítopos clave ("puntos calientes" energéticos) [26] para mAbs que se unen al mismo grupo de aminoácidos.
- Matriz basados en oligo-péptido de exploración. También conocida como exploración de péptidos superpuestos o análisis pepscan , esta técnica utiliza una biblioteca de secuencias de oligopéptidos de segmentos superpuestos y no superpuestos de una proteína diana, y prueba su capacidad para unirse al anticuerpo de interés. Este método es rápido, relativamente económico y específicamente adecuado para perfilar epítopos para un gran número de anticuerpos candidatos contra una diana definida. [20] [27] La resolución del mapeo de epítopos depende del número de péptidos superpuestos que se utilizan. La principal desventaja de este enfoque es que los epítopos discontinuos se deconstruyen en péptidos más pequeños, lo que puede causar afinidades de unión más bajas. Sin embargo, se han realizado avances con tecnologías tales como péptidos restringidos, que pueden usarse para imitar epítopos conformacionales y discontinuos. Por ejemplo, un anticuerpo contra CD20 fue mapeado en un estudio [28] usando escaneo de oligopéptidos basado en matriz, combinando secuencias de péptidos no adyacentes de diferentes partes de la proteína diana y reforzando la rigidez conformacional en este péptido combinado (p. Ej., Mediante utilizando andamios CLIPS [29] ). El análisis de reemplazo en péptidos también permite la resolución de un solo aminoácido y, por lo tanto, puede identificar residuos de epítopos clave.
- Mapeo de mutagénesis dirigida al sitio . La técnica de biología molecular de mutagénesis dirigida al sitio (SDM) puede usarse para permitir el mapeo de epítopos. En SDM,se introducen mutaciones sistemáticasde aminoácidos en la secuencia de la proteína diana. Se prueba la unión de un anticuerpo a cada proteína mutada para identificar los aminoácidos que comprenden el epítopo. Esta técnica puede usarse para mapear epítopos tanto lineales como conformacionales, pero es laboriosa y requiere mucho tiempo, y típicamente limita el análisis a un pequeño número de residuos de aminoácidos. [2]
- Mapeo de epítopos de mutagénesis de escopeta de alto rendimiento. [2] [10] [30] La mutagénesis de escopeta es un enfoque de alto rendimiento para mapear los epítopos de mAb. [30] La técnica de mutagénesis escopeta comienza con la creación de una biblioteca de mutaciones del antígeno diana completo , con cada clon que contiene una mutación de aminoácido única (típicamente una sustitución de alanina). Cientos de clones de plásmido de la biblioteca se ordenan individualmente en microplacas de 384 pocillos, se expresan en células humanas y se analizan para determinar la unión de anticuerpos. Los aminoácidos de la diana necesarios para la unión del anticuerpo se identifican mediante una pérdida de inmunorreactividad. Estos residuos se mapean en estructuras de la proteína diana para visualizar el epítopo. Los beneficios del mapeo de epítopos de mutagénesis de escopeta de alto rendimiento incluyen: 1) la capacidad de identificar epítopos lineales y conformacionales, 2) un tiempo de ensayo más corto que otros métodos, 3) la presentación de proteínas correctamente plegadas y modificadas postraduccionalmente, y 4) la capacidad de identificar los aminoácidos clave que impulsan las interacciones energéticas ("puntos calientes" energéticos del epítopo). [26] [31]
- Intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX). Este método proporciona información sobre la accesibilidad al disolvente de varias partes del antígeno y del anticuerpo, lo que demuestra una accesibilidad reducida al disolvente en regiones de interacciones proteína-proteína. [32] Una de sus ventajas es que determina el sitio de interacción del complejo antígeno-anticuerpo en su solución nativa y no introduce ninguna modificación (por ejemplo, mutación) ni en el antígeno ni en el anticuerpo. También se ha demostrado que el mapeo de epítopos de HDX es el método eficaz para proporcionar rápidamente información completa para la estructura del epítopo. [33] Por lo general, no proporciona datos a nivel de aminoácidos, pero esta limitación se está mejorando con los avances de la nueva tecnología. [34] Recientemente se ha recomendado como un enfoque de mapeo de epítopos rápido y rentable, [35] utilizando el complejo sistema de proteínas hemaglutinina de la influenza como ejemplo.
- Espectrometría de masas con reticulación acoplada. [36] El anticuerpo y el antígeno se unen a un reticulante marcado y la formación del complejo se confirma mediante la detección de MALDI de gran masa . La ubicación de unión del anticuerpo al antígeno puede identificarse luego mediante espectrometría de masas (MS). El complejo reticulado es muy estable y puede exponerse a diversas condiciones enzimáticas y de digestión, lo que permite la detección de muchas opciones de péptidos diferentes. Se utilizan técnicas de MS o MS / MS para detectar las ubicaciones de los aminoácidos de los reticuladores marcados y los péptidos unidos (tanto el epítopo como el paratopo se determinan en un experimento). La ventaja clave de esta técnica es la alta sensibilidad de la detección de EM, lo que significa que se necesita muy poco material (cientos de microgramos o menos).
Otros métodos, tales como de presentación en levadura , presentación de fagos , [37] y limitada proteólisis , proporcionan de alto rendimiento seguimiento de la unión del anticuerpo, pero carecen de resolución, especialmente para los epítopos conformacionales. [38]
Ver también
- Agrupación de epítopos
Referencias
- ^ DeLisser, HM (1999). "Mapeo de epítopos". Protocolos de proteínas de adhesión . Métodos Mol Biol. 96 . págs. 11-20. doi : 10.1385 / 1-59259-258-9: 11 . ISBN 978-1-59259-258-6. PMID 10098119 .
- ^ a b c Davidson, E; Doranz, B (2014). "Un enfoque de mutagénesis de escopeta de alto rendimiento para mapear epítopos de anticuerpos de células B" . Inmunologia . 143 (1): 13-20. doi : 10.1111 / imm.12323 . PMC 4137951 . PMID 24854488 .
- ^ Westwood, Olwyn MR; Hay, Frank C., eds. (2001). Mapeo de epítopos: un enfoque práctico . Oxford, Oxfordshire: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963652-5.[ página necesaria ]
- ^ Gershoni, JM; Roitburd-Berman, A; Siman-Tov, DD; Tarnovitski Freund, N; Weiss, Y (2007). "Mapeo de epítopos: el primer paso en el desarrollo de vacunas basadas en epítopos" . Biofármacos . 21 (3): 145–56. doi : 10.2165 / 00063030-200721030-00002 . PMC 7100438 . PMID 17516710 . S2CID 29506607 .
- ^ a b Zafiro, EO (2018). et al. "El análisis sistemático de anticuerpos monoclonales frente al virus del Ébola GP define características que contribuyen a la protección" . Celular . 174 (4): P938–52. doi : 10.1016 / j.cell.2018.07.033 . PMC 6102396 . PMID 30096313 .
- ^ Dutton, G (1 de enero de 2016). "Tamaños moleculares integrales hasta Ébola: especialista en proteínas de membrana mapea los sitios de unión del Ébola para avanzar en el descubrimiento de vacunas" . Noticias de Ingeniería Genética y Biotecnología . 36 (1).
- ^ Ahmad, TA; Eweida, A; Sheweita, SA (2016). "Mapeo de epítopos de células B para el diseño de vacunas y diagnósticos efectivos" . Ensayos de vacunación . 5 : 71–83. doi : 10.1016 / j.trivac.2016.04.003 .
- ^ Ahmad, TA; Eweida, A; El-Sayed, LH (2016). "Mapeo de epítopos de células T para el diseño de vacunas potentes" . Informes de vacunas . 6 : 13-22. doi : 10.1016 / j.vacrep.2016.07.002 .
- ^ Davidson, E; et al. (2015). "Mecanismo de unión a la glicoproteína del virus del Ébola por los anticuerpos cóctel ZMapp, ZMAb y MB-003" . Revista de Virología . 89 (21): 10982–92. doi : 10.1128 / JVI.01490-15 . PMC 4621129 . PMID 26311869 .
- ^ a b c Banik, S; Deng, X; Doranz, B (2017). "Uso de mapeo de epítopos para obtener más valor de mAbs" . Noticias de Ingeniería Genética y Biotecnología . 37 (15).
- ^ a b c Deng, X; Storz, U; Doranz, BJ (2018). "Mejora de la protección de patentes de anticuerpos utilizando información de mapeo de epítopos" . mAbs . 10 (2): 204–9. doi : 10.1080 / 19420862.2017.1402998 . PMC 5825199 . PMID 29120697 .
- ^ a b Ledford, H (2018). "La prisa por proteger las lucrativas patentes de anticuerpos se pone en marcha" . Naturaleza . 557 (7707): 623–624. Código Bib : 2018Natur.557..623L . doi : 10.1038 / d41586-018-05273-z . PMID 29844545 .
- ^ Potocnakova, L; Bhide, M; Pulzova, LB (2017). "Una introducción al mapeo de epítopos de células B y predicción de epítopos in silico" . Revista de investigación en inmunología . 2016 : 1–11. doi : 10.1155 / 2016/6760830 . PMC 5227168 . PMID 28127568 .
- ^ a b Banik, SSR; Doranz, BJ (2010). "Mapeo de epítopos de anticuerpos complejos" . Noticias de Ingeniería Genética y Biotecnología . 3 (2): 25–8.
- ^ Zhang, R; et al. (2018). "Mxra8 es un receptor de múltiples alfavirus artritógenos" . Naturaleza . 557 (7706): 570–4. Código Bib : 2018Natur.557..570Z . doi : 10.1038 / s41586-018-0121-3 . PMC 5970976 . PMID 29769725 .
- ^ Nivarthi, Reino Unido; et al. (2017). "Mapeo de las respuestas de anticuerpos neutralizantes de suero y células B de memoria humana a la infección y vacunación del serotipo 4 del virus del dengue" . Revista de Virología . 91 (5): e02041–16. doi : 10.1128 / JVI.02041-16 . PMC 5309932 . PMID 28031369 .
- ^ Flyak AI; et al. (2018). "Los anticuerpos ampliamente neutralizantes de los supervivientes humanos se dirigen a un sitio conservado en la región de la glicoproteína HR2-MPER del virus del Ébola" . Microbiología de la naturaleza . 3 (6): 670–677. doi : 10.1038 / s41564-018-0157-z . PMC 6030461 . PMID 29736037 .
- ^ Zhao, X; et al. (2017). "El anticuerpo ampliamente protector provocado por la inmunización revela el bucle de fusión del ébolavirus como un sitio de vulnerabilidad" . Celular . 169 (5): 891–904. doi : 10.1016 / j.cell.2017.04.038 . PMC 5803079 . PMID 28525756 .
- ^ Sapparapu, G; et al. (2016). "Los anticuerpos humanos neutralizantes previenen la replicación del virus Zika y la enfermedad fetal en ratones" . Naturaleza . 540 (7633): 443–7. Código Bib : 2016Natur.540..443S . doi : 10.1038 / nature20564 . PMC 5583716 . PMID 27819683 .
- ^ a b Gaseitsiwe, S .; et al. (2010). "Identificación basada en micromatrices de péptidos del epítopo de Mycobacterium tuberculosis que se une a HLA-DRB1 * 0101, DRB1 * 1501 y DRB1 * 0401" . Inmunología clínica y vacunal . 17 (1): 168–75. doi : 10.1128 / CVI.00208-09 . PMC 2812096 . PMID 19864486 .
- ^ a b Paes, C; et al. (2009). "Mapeo a nivel atómico de epítopos de anticuerpos en un GPCR" . Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 131 (20): 6952–6954. doi : 10.1021 / ja900186n . PMC 2943208 . PMID 19453194 .
- ^ a b Sandercock, CG; Storz, U (2012). "Especificación del anticuerpo más allá de la diana: reivindicando un anticuerpo terapéutico de última generación por su epítopo diana". Biotecnología de la naturaleza . 30 (7): 615–618. doi : 10.1038 / nbt.2291 . PMID 22781681 . S2CID 52810327 .
- ^ Teeling, TJ; et al. (2006). "La actividad biológica de los anticuerpos monoclonales CD20 humanos está vinculada a epítopos únicos en CD20" . Revista de inmunología . 177 (1): 362–71. doi : 10.4049 / jimmunol.177.1.362 . ISSN 0022-1767 . PMID 16785532 .
- ^ "Amgen Inc. y col. Contra Sanofi y col . " . Consultado el 23 de julio de 2017 .
- ^ Largo, F; et al. (2015). "Las estructuras Cryo-EM dilucidan los mecanismos de neutralización de los anticuerpos monoclonales humanos anti-chikungunya con actividad terapéutica" . PNAS . 112 (45): 13898-13903. Código bibliográfico : 2015PNAS..11213898L . doi : 10.1073 / pnas.1515558112 . PMC 4653152 . PMID 26504196 .
- ^ a b Bogan, AA; Thorn, KS (1998). "Anatomía de puntos calientes en interfaces de proteínas". Revista de Biología Molecular . 280 (1): 1–9. doi : 10.1006 / jmbi.1998.1843 . PMID 9653027 . S2CID 11014160 .
- ^ Linnebacher, M; et al. (2012). "Caracterización de clonalidad de anticuerpos específicos de epítopo natural contra el antígeno relacionado con el tumor topoisomerasa IIa por chip de péptido y análisis de proteoma: un estudio piloto con muestras de pacientes con carcinoma colorrectal". Química analítica y bioanalítica . 403 (1): 227–38. doi : 10.1007 / s00216-012-5781-5 . PMID 22349330 . S2CID 33847079 .
- ^ Cragg, MS (2011). "Anticuerpos CD20: haciendo la deformación del tiempo" . Sangre . 118 (2): 219-20. doi : 10.1182 / sangre-2011-04-346700 . PMID 21757627 .
- ^ Timmerman, P; et al. (2009). "Reconstrucción funcional de epítopos estructuralmente complejos utilizando tecnología CLIPS ™" (PDF) . The Open Vaccine Journal . 2 (1): 56–67. doi : 10.2174 / 1875035400902010056 . hdl : 11245 / 1.309707 .
- ^ a b "Servicios de mapeo de epítopos" . Molecular Integral . Consultado el 21 de septiembre de 2018 .
- ^ Lo Conte, L; Chotia, C; Janin, J (1999). "La estructura atómica de los sitios de reconocimiento de proteína-proteína". Revista de Biología Molecular . 285 (5): 2177–2198. doi : 10.1006 / jmbi.1998.2439 . PMID 9925793 . S2CID 20154946 .
- ^ Casina, VC; et al. (2014). "El mapeo de epítopos de autoanticuerpos por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio con una resolución de residuo de aminoácido casi único revela exositos novedosos en ADAMTS13 críticos para el reconocimiento de sustratos y el mecanismo de la púrpura trombocitopénica trombótica autoinmune" . Sangre . 124 (21): 108. doi : 10.1182 / blood.V124.21.108.108 .
- ^ Malito, E .; Faleri, A .; Surdo, PL; Veggi, D .; Maruggi, G .; Grassi, E .; Cartocci, E .; Bertoldi, I .; Genovese, A .; Santini, L .; Romagnoli, G. (2013). "Definición de un epítopo protector en la proteína de unión del factor H, un factor clave de virulencia meningocócica y antígeno de la vacuna" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 110 (9): 3304–3309. Código Bibliográfico : 2013PNAS..110.3304M . doi : 10.1073 / pnas.1222845110 . ISSN 0027-8424 . PMC 3587270 . PMID 23396847 .
- ^ Pan, J. (2019). "Mapeo de epítopos de anticuerpos en resolución de residuo único para antígenos no purificados" . La revista de inmunología . 202 (1 Suplemento): 131.36. ISSN 0022-1767 .
- ^ Puchades, C .; Kűkrer, B .; Diefenbach, O .; Sneekes-Vriese, E .; Juraszek, J .; Koudstaal, W .; Apetri, A. (2019). "Mapeo de epítopos de diversos candidatos a fármaco hemaglutinina de influenza usando HDX-MS" . Informes científicos . 9 (1): 4735. Bibcode : 2019NatSR ... 9.4735P . doi : 10.1038 / s41598-019-41179-0 . ISSN 2045-2322 . PMC 6427009 . PMID 30894620 .
- ^ "Mapeo de epítopos" . www.covalx.com/epitope2 . Consultado el 23 de febrero de 2017 .
- ^ Mendonça, M; et al. (2016). "Fructosa 1,6-bisfosfato aldolasa, una nueva proteína inmunogénica de superficie en especies de Listeria" . PLOS ONE . 11 (8): e0160544. Código Bibliográfico : 2016PLoSO..1160544M . doi : 10.1371 / journal.pone.0160544 . PMC 4973958 . PMID 27489951 .
- ^ Flanagan, N (15 de mayo de 2011). "Mapeo de epítopos con especificación de masas H / D-ex: ExSAR amplía el repertorio de la plataforma tecnológica más allá de la caracterización de proteínas" . Noticias de Ingeniería Genética y Biotecnología . 31 (10). doi : 10.1089 / gen.31.10.02 .
enlaces externos
- Mapeo de epítopo + en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .