Plegado de proteínas

El plegamiento de proteínas es el proceso físico mediante el cual una cadena de proteínas se traduce a su estructura tridimensional nativa , típicamente una conformación "plegada" mediante la cual la proteína se vuelve biológicamente funcional. Mediante un proceso rápido y reproducible, un polipéptido se pliega en su estructura tridimensional característica a partir de una espiral aleatoria . [1] Cada proteína existe primero como un polipéptido desplegado o una espiral aleatoria después de ser traducida de una secuencia de ARNm a una cadena lineal de aminoácidos.. En esta etapa, el polipéptido carece de cualquier estructura tridimensional estable (de larga duración) (el lado izquierdo de la primera figura). A medida que un ribosoma sintetiza la cadena polipeptídica , la cadena lineal comienza a plegarse en su estructura tridimensional.

Proteína antes y después del plegado
Resultados del plegamiento de proteínas

El plegamiento de muchas proteínas comienza incluso durante la traducción de la cadena polipeptídica. Los aminoácidos interactúan entre sí para producir una estructura tridimensional bien definida, la proteína plegada (el lado derecho de la figura), conocida como estado nativo . La estructura tridimensional resultante está determinada por la secuencia de aminoácidos o la estructura primaria ( dogma de Anfinsen ). [2]

La estructura tridimensional correcta es esencial para el funcionamiento, aunque algunas partes de las proteínas funcionales pueden permanecer desplegadas , [3] por lo que la dinámica de las proteínas es importante. La falta de plegado en la estructura nativa generalmente produce proteínas inactivas, pero en algunos casos las proteínas mal plegadas tienen una funcionalidad modificada o tóxica. Se cree que varias enfermedades neurodegenerativas y de otro tipo son el resultado de la acumulación de fibrillas amiloides formadas por proteínas mal plegadas. [4] Muchas alergias son causadas por un plegamiento incorrecto de algunas proteínas, porque el sistema inmunológico no produce anticuerpos para ciertas estructuras proteicas. [5]

La desnaturalización de las proteínas es un proceso de transición del estado plegado al desplegado . Ocurre en la cocina , en las quemaduras , en las proteinopatías y en otros contextos.

La duración del proceso de plegado varía drásticamente según la proteína de interés. Cuando se estudian fuera de la célula , las proteínas de plegamiento más lento requieren muchos minutos u horas para plegarse principalmente debido a la isomerización de prolina , y deben pasar por una serie de estados intermedios, como puntos de control, antes de que se complete el proceso. [6] Por otro lado, las proteínas de dominio único muy pequeñas con longitudes de hasta cien aminoácidos normalmente se pliegan en un solo paso. [7] Las escalas de tiempo de milisegundos son la norma y las reacciones de plegamiento de proteínas conocidas más rápidas se completan en unos pocos microsegundos. [8]

Comprender y simular el proceso de plegamiento de proteínas ha sido un desafío importante para la biología computacional desde finales de la década de 1960.

Estructura primaria

La estructura primaria de una proteína , su secuencia lineal de aminoácidos, determina su conformación nativa. [9] Los residuos de aminoácidos específicos y su posición en la cadena polipeptídica son los factores determinantes por los cuales las porciones de la proteína se pliegan muy juntas y forman su conformación tridimensional. La composición de aminoácidos no es tan importante como la secuencia. [10] El hecho esencial del plegamiento, sin embargo, sigue siendo que la secuencia de aminoácidos de cada proteína contiene la información que especifica tanto la estructura nativa como la vía para alcanzar ese estado. Esto no quiere decir que las secuencias de aminoácidos casi idénticas siempre se pliegan de manera similar. [11] Las conformaciones también difieren según los factores ambientales; proteínas similares se pliegan de manera diferente según el lugar donde se encuentran.

Estructura secundaria

La formación en espiral de la hélice alfa
Una hoja plisada beta anti-paralela que muestra enlaces de hidrógeno dentro de la columna vertebral

La formación de una estructura secundaria es el primer paso en el proceso de plegamiento que toma una proteína para asumir su estructura nativa. Características de la estructura secundaria son las estructuras conocidas como hélices alfa y láminas beta que se pliegan rápidamente porque están estabilizadas por enlaces de hidrógeno intramoleculares , como lo caracterizó por primera vez Linus Pauling . La formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares proporciona otra contribución importante a la estabilidad de las proteínas. [12] Las hélices α se forman mediante enlaces de hidrógeno de la columna vertebral para formar una forma de espiral (consulte la figura de la derecha). [10] La hoja plisada β es una estructura que se forma con la columna vertebral doblada sobre sí misma para formar los enlaces de hidrógeno (como se muestra en la figura de la izquierda). Los enlaces de hidrógeno se encuentran entre el hidrógeno amida y el oxígeno del carbonilo del enlace peptídico . Existen láminas plisadas β anti-paralelas y láminas plegadas β paralelas donde la estabilidad de los enlaces de hidrógeno es más fuerte en la hoja β antiparalela ya que se une a hidrógeno con el ángulo ideal de 180 grados en comparación con los enlaces de hidrógeno inclinados formados por láminas paralelas. [10]

Estructura terciaria

Las hélices alfa y las láminas plisadas beta pueden ser de naturaleza anfipática o contener una parte hidrófila y una parte hidrófoba. Esta propiedad de las estructuras secundarias ayuda a la estructura terciaria de una proteína en la que se produce el plegamiento de modo que los lados hidrófilos se enfrentan al entorno acuoso que rodea a la proteína y los lados hidrófobos miran al núcleo hidrófobo de la proteína. [13] La estructura secundaria da paso jerárquicamente a la formación de la estructura terciaria. Una vez que la estructura terciaria de la proteína está formada y estabilizada por las interacciones hidrófobas, también puede haber enlaces covalentes en forma de puentes disulfuro formados entre dos residuos de cisteína . La estructura terciaria de una proteína implica una sola cadena polipeptídica; sin embargo, interacciones adicionales de cadenas polipeptídicas plegadas dan lugar a la formación de estructuras cuaternarias. [14]

Estructura cuaternaria

La estructura terciaria puede dar lugar a la formación de estructura cuaternaria en algunas proteínas, lo que generalmente implica el "ensamblaje" o "co-ensamblaje" de subunidades que ya se han plegado; en otras palabras, múltiples cadenas polipeptídicas podrían interactuar para formar una proteína cuaternaria completamente funcional. [10]

Fuerzas impulsoras del plegamiento de proteínas

Todas las formas de estructura proteica resumidas

El plegamiento es un proceso espontáneo que está guiado principalmente por interacciones hidrofóbicas, formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares , fuerzas de van der Waals y se opone a la entropía conformacional . [15] El proceso de plegamiento a menudo comienza co-traduccionalmente , de modo que el extremo N-terminal de la proteína comienza a plegarse mientras que la porción C-terminal de la proteína todavía está siendo sintetizada por el ribosoma ; sin embargo, una molécula de proteína puede plegarse espontáneamente durante o después de la biosíntesis . [16] Si bien estas macromoléculas pueden considerarse como " plegables ", el proceso también depende del disolvente ( agua o bicapa lipídica ), [17] la concentración de sales , el pH , la temperatura , la posible presencia de cofactores y de chaperones moleculares .

Las proteínas tendrán limitaciones en sus capacidades de plegado debido a los ángulos de flexión restringidos o conformaciones que son posibles. Estos ángulos permisibles de plegamiento de proteínas se describen con una gráfica bidimensional conocida como gráfica de Ramachandran , representada con ángulos psi y phi de rotación permitida. [18]

Efecto hidrofóbico

Colapso hidrofóbico . En el pliegue compacto (a la derecha), los aminoácidos hidrofóbicos (mostrados como esferas negras) colapsan hacia el centro para protegerse del ambiente acuoso.

El plegamiento de proteínas debe ser termodinámicamente favorable dentro de una célula para que sea una reacción espontánea. Dado que se sabe que el plegamiento de proteínas es una reacción espontánea, debe asumir un valor de energía libre de Gibbs negativo . La energía libre de Gibbs en el plegamiento de proteínas está directamente relacionada con la entalpía y la entropía . [10] Para que surja un delta G negativo y para que el plegamiento de proteínas se vuelva termodinámicamente favorable, entonces la entalpía, la entropía o ambos términos deben ser favorables.

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La entropía disminuye a medida que las moléculas de agua se vuelven más ordenadas cerca del soluto hidrófobo.

Minimizar el número de cadenas laterales hidrófobas expuestas al agua es una fuerza impulsora importante detrás del proceso de plegado. [19] El efecto hidrofóbico es el fenómeno en el que las cadenas hidrofóbicas de una proteína colapsan en el núcleo de la proteína (lejos del ambiente hidrofílico). [10] En un ambiente acuoso, las moléculas de agua tienden a agregarse alrededor de las regiones hidrofóbicas o cadenas laterales de la proteína, creando capas de agua de moléculas de agua ordenadas. [20] Un orden de las moléculas de agua alrededor de una región hidrófoba aumenta el orden en un sistema y, por lo tanto, contribuye a un cambio negativo en la entropía (menos entropía en el sistema). Las moléculas de agua están fijadas en estas jaulas de agua, lo que impulsa el colapso hidrofóbico o el plegamiento hacia adentro de los grupos hidrofóbicos. El colapso hidrófobo devuelve la entropía al sistema a través de la rotura de las jaulas de agua, lo que libera las moléculas de agua ordenadas. [10] La multitud de grupos hidrofóbicos que interactúan dentro del núcleo de la proteína plegada globular contribuye en una cantidad significativa a la estabilidad de la proteína después del plegado, debido a las fuerzas de van der Waals acumuladas enormemente (específicamente las fuerzas de dispersión de Londres ). [10] El efecto hidrofóbico existe como fuerza impulsora en termodinámica solo si existe la presencia de un medio acuoso con una molécula anfifílica que contiene una gran región hidrofóbica. [21] La fuerza de los enlaces de hidrógeno depende de su entorno; por tanto, los enlaces H envueltos en un núcleo hidrófobo contribuyen más que los enlaces H expuestos al medio acuoso a la estabilidad del estado nativo. [22]

En las proteínas con pliegues globulares, los aminoácidos hidrófobos tienden a estar intercalados a lo largo de la secuencia primaria, en lugar de distribuirse al azar o agruparse. [23] [24] Sin embargo, las proteínas que han nacido recientemente de novo , que tienden a estar intrínsecamente desordenadas , [25] [26] muestran el patrón opuesto de agrupamiento de aminoácidos hidrófobos a lo largo de la secuencia primaria. [27]

Acompañantes

Ejemplo de una pequeña proteína eucariota de choque térmico

Las chaperonas moleculares son una clase de proteínas que ayudan al plegamiento correcto de otras proteínas in vivo . Las chaperonas existen en todos los compartimentos celulares e interactúan con la cadena polipeptídica para permitir que se forme la conformación tridimensional nativa de la proteína; sin embargo, las chaperonas mismas no están incluidas en la estructura final de la proteína en la que están ayudando. [28] Las chaperonas pueden ayudar en el plegamiento incluso cuando el ribosoma sintetiza el polipéptido naciente. [29] Las chaperonas moleculares operan uniéndose para estabilizar una estructura inestable de una proteína en su ruta de plegado, pero las chaperonas no contienen la información necesaria para conocer la estructura nativa correcta de la proteína a la que ayudan; más bien, las chaperonas funcionan previniendo conformaciones de plegado incorrectas. [29] De esta manera, los chaperones en realidad no aumentan la tasa de pasos individuales involucrados en el camino de plegado hacia la estructura nativa; en su lugar, funcionan reduciendo posibles agregaciones no deseadas de la cadena polipeptídica que de otro modo podrían ralentizar la búsqueda del intermedio adecuado y proporcionan una ruta más eficiente para que la cadena polipeptídica adopte las conformaciones correctas. [28] Las chaperonas no deben confundirse con las proteínas catalizadoras de plegamiento , que catalizan las reacciones químicas responsables de los pasos lentos en las vías de plegado. Ejemplos de catalizadores de plegamiento son proteínas disulfuro isomerasas y peptidil-prolil isomerasas que pueden estar implicadas en la formación de enlaces disulfuro o en la interconversión entre estereoisómeros cis y trans del grupo peptídico. [29] Se ha demostrado que las chaperonas son críticas en el proceso de plegamiento de proteínas in vivo porque proporcionan a la proteína la ayuda necesaria para asumir sus alineaciones y conformaciones adecuadas de manera suficientemente eficiente como para volverse "biológicamente relevantes". [30] Esto significa que, en teoría, la cadena polipeptídica podría plegarse en su estructura nativa sin la ayuda de chaperonas, como lo demuestran los experimentos de plegamiento de proteínas realizados in vitro ; [30] sin embargo, este proceso resulta ser demasiado ineficaz o demasiado lento para existir en los sistemas biológicos; por lo tanto, las chaperonas son necesarias para el plegamiento de proteínas in vivo. Junto con su papel para ayudar a la formación de estructuras nativas, las chaperonas están involucradas en varios roles, como el transporte de proteínas, la degradación e incluso permiten que las proteínas desnaturalizadas expuestas a ciertos factores desnaturalizantes externos tengan la oportunidad de replegarse en sus estructuras nativas correctas. [31]

Una proteína completamente desnaturalizada carece de estructura terciaria y secundaria, y existe como una llamada espiral aleatoria . En determinadas condiciones, algunas proteínas pueden replegarse; sin embargo, en muchos casos, la desnaturalización es irreversible. [32] Las células a veces protegen sus proteínas contra la influencia desnaturalizante del calor con enzimas conocidas como proteínas de choque térmico (un tipo de chaperona), que ayudan a otras proteínas tanto a plegarse como a permanecer plegadas. Se han encontrado proteínas de choque térmico en todas las especies examinadas, desde bacterias hasta humanos, lo que sugiere que evolucionaron muy temprano y tienen una función importante. Algunas proteínas nunca se pliegan en las células excepto con la ayuda de chaperonas que aíslan proteínas individuales para que su plegamiento no se interrumpa por interacciones con otras proteínas o ayudan a desplegar proteínas mal plegadas, lo que les permite replegarse en la estructura nativa correcta. [33] Esta función es crucial para prevenir el riesgo de precipitación en agregados amorfos insolubles . Los factores externos involucrados en la desnaturalización de las proteínas o la interrupción del estado nativo incluyen la temperatura, los campos externos (eléctricos, magnéticos), [34] apiñamiento molecular, [35] e incluso la limitación del espacio (es decir, el confinamiento), que pueden tener una gran influencia. sobre el plegamiento de proteínas. [36] Las altas concentraciones de solutos , los extremos de pH , las fuerzas mecánicas y la presencia de desnaturalizantes químicos también pueden contribuir a la desnaturalización de las proteínas. Estos factores individuales se clasifican juntos como tensiones. Se ha demostrado que las chaperonas existen en concentraciones crecientes durante los momentos de estrés celular y ayudan al plegamiento adecuado de las proteínas emergentes, así como las desnaturalizadas o mal plegadas. [28]

En algunas condiciones, las proteínas no se plegarán en sus formas bioquímicamente funcionales. Las temperaturas por encima o por debajo del rango en el que las células tienden a vivir harán que las proteínas térmicamente inestables se desplieguen o desnaturalicen (esta es la razón por la cual la ebullición hace que la clara de huevo se vuelva opaca). Sin embargo, la estabilidad térmica de las proteínas dista mucho de ser constante; por ejemplo, se han encontrado bacterias hipertermófilas que crecen a temperaturas tan altas como 122 ° C, [37] lo que, por supuesto, requiere que su complemento completo de proteínas vitales y conjuntos de proteínas sea estable a esa temperatura o más.

La bacteria E. coli es el huésped del bacteriófago T4 , y la proteína gp31 codificada por el fago ( P17313 ) parece ser estructural y funcionalmente homóloga a la proteína chaperona GroES de E. coli y capaz de sustituirla en el ensamblaje de las partículas del virus del bacteriófago T4 durante infección. [38] Al igual que GroES, gp31 forma un complejo estable con la chaperonina GroEL que es absolutamente necesario para el plegado y ensamblaje in vivo de la proteína gp23 de la cápside principal del bacteriófago T4. [38]

Cambio de pliegue

Algunas proteínas tienen múltiples estructuras nativas y cambian su pliegue en función de algunos factores externos. Por ejemplo, los cambios de proteína KaiB se pliegan a lo largo del día , actuando como un reloj para las cianobacterias. Se ha estimado que entre el 0,5 y el 4% de las proteínas PDB ( Protein Data Bank ) cambian de pliegue. [39]

Se considera que una proteína está mal plegada si no puede alcanzar su estado nativo normal. Esto puede deberse a mutaciones en la secuencia de aminoácidos o una interrupción del proceso de plegamiento normal por factores externos. [40] La proteína mal plegada normalmente contiene láminas β que están organizadas en una disposición supramolecular conocida como estructura β cruzada. Estos conjuntos ricos en láminas β son muy estables, muy insolubles y generalmente resistentes a la proteólisis. [41] La estabilidad estructural de estos conjuntos fibrilares es causada por interacciones extensas entre los monómeros de proteína, formados por enlaces de hidrógeno de la cadena principal entre sus cadenas β. [41] El plegamiento incorrecto de las proteínas puede desencadenar un plegamiento incorrecto adicional y la acumulación de otras proteínas en agregados u oligómeros. El aumento de los niveles de proteínas agregadas en la célula conduce a la formación de estructuras de tipo amiloide que pueden causar trastornos degenerativos y muerte celular. [40] Los amiloides son estructuras fibrilares que contienen enlaces de hidrógeno intermoleculares que son altamente insolubles y están hechos de agregados de proteínas convertidas. [40] Por lo tanto, la vía del proteasoma puede no ser lo suficientemente eficiente como para degradar las proteínas mal plegadas antes de la agregación. Las proteínas mal plegadas pueden interactuar entre sí y formar agregados estructurados y ganar toxicidad a través de interacciones intermoleculares. [40]

Las proteínas agregadas están asociadas con enfermedades relacionadas con priones como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob , encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas), enfermedades relacionadas con amiloide como la enfermedad de Alzheimer y la miocardiopatía o polineuropatía amiloide familiar , [42] así como enfermedades de agregación intracelular como como enfermedad de Huntington y Parkinson . [4] [43] Estas enfermedades degenerativas de aparición con la edad se asocian con la agregación de proteínas mal plegadas en agregados extracelulares insolubles y / o inclusiones intracelulares, incluidas las fibrillas de amiloide β cruzadas . No está del todo claro si los agregados son la causa o simplemente un reflejo de la pérdida de la homeostasis de las proteínas, el equilibrio entre la síntesis, el plegamiento, la agregación y el recambio de proteínas. Recientemente, la Agencia Europea de Medicamentos aprobó el uso de Tafamidis o Vyndaqel (un estabilizador cinético de la transtiretina tetramérica) para el tratamiento de las enfermedades amiloideas por transtiretina. Esto sugiere que el proceso de formación de fibrillas de amiloide (y no las propias fibrillas) causa la degeneración del tejido posmitótico en las enfermedades amiloides humanas. [44] El plegamiento incorrecto y la degradación excesiva en lugar del plegamiento y la función conducen a una serie de enfermedades proteicas como el enfisema asociado a la antitripsina , la fibrosis quística y las enfermedades de almacenamiento lisosómico , donde la pérdida de la función es el origen del trastorno. Si bien la terapia de reemplazo de proteínas se ha usado históricamente para corregir estos últimos trastornos, un enfoque emergente es usar chaperonas farmacéuticas para doblar las proteínas mutadas para hacerlas funcionales.

Si bien se pueden hacer inferencias sobre el plegamiento de proteínas a través de estudios de mutación , típicamente, las técnicas experimentales para estudiar el plegamiento de proteínas se basan en el despliegue o plegamiento gradual de proteínas y la observación de cambios conformacionales utilizando técnicas estándar no cristalográficas.

Cristalografía de rayos X

Pasos de la cristalografía de rayos X

La cristalografía de rayos X es uno de los métodos más eficientes e importantes para intentar descifrar la configuración tridimensional de una proteína plegada. [45] Para poder realizar cristalografía de rayos X, la proteína bajo investigación debe estar ubicada dentro de una red cristalina. Para colocar una proteína dentro de una red cristalina, se debe tener un solvente adecuado para la cristalización, obtener una proteína pura a niveles sobresaturados en solución y precipitar los cristales en solución. [46] Una vez que se cristaliza una proteína, los haces de rayos X se pueden concentrar a través de la red cristalina que difracta los haces o los dispara hacia afuera en varias direcciones. Estos haces que salen se correlacionan con la configuración tridimensional específica de la proteína encerrada en su interior. Los rayos X interactúan específicamente con las nubes de electrones que rodean a los átomos individuales dentro de la red cristalina de proteínas y producen un patrón de difracción discernible. [13] Sólo relacionando las nubes de densidad de electrones con la amplitud de los rayos X se puede leer este patrón y conducir a suposiciones de las fases o ángulos de fase involucrados que complican este método. [47] Sin la relación establecida mediante una base matemática conocida como transformada de Fourier , el " problema de fase " haría muy difícil predecir los patrones de difracción. [13] Los métodos emergentes como el reemplazo isomorfo múltiple utilizan la presencia de un ión de metal pesado para difractar los rayos X de una manera más predecible, reduciendo el número de variables involucradas y resolviendo el problema de fase. [45]

Espectroscopia de fluorescencia

La espectroscopia de fluorescencia es un método muy sensible para estudiar el estado de plegamiento de las proteínas. Tres aminoácidos, fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptófano (Trp), tienen propiedades de fluorescencia intrínsecas, pero solo Tyr y Trp se usan experimentalmente porque sus rendimientos cuánticos son lo suficientemente altos como para dar buenas señales de fluorescencia. Tanto Trp como Tyr se excitan con una longitud de onda de 280 nm, mientras que solo Trp se excita con una longitud de onda de 295 nm. Debido a su carácter aromático, los residuos de Trp y Tyr a menudo se encuentran total o parcialmente enterrados en el núcleo hidrófobo de proteínas, en la interfaz entre dos dominios proteicos o en la interfaz entre subunidades de proteínas oligoméricas. En este entorno apolar, tienen altos rendimientos cuánticos y, por lo tanto, altas intensidades de fluorescencia. Tras la interrupción de la estructura terciaria o cuaternaria de la proteína, estas cadenas laterales quedan más expuestas al entorno hidrófilo del disolvente y sus rendimientos cuánticos disminuyen, lo que conduce a bajas intensidades de fluorescencia. Para los residuos de Trp, la longitud de onda de su máxima emisión de fluorescencia también depende de su entorno.

La espectroscopia de fluorescencia se puede utilizar para caracterizar el despliegue en equilibrio de las proteínas midiendo la variación en la intensidad de la emisión de fluorescencia o en la longitud de onda de la emisión máxima como funciones de un valor desnaturalizante. [48] [49] El desnaturalizante puede ser una molécula química (urea, clorhidrato de guanidinio), temperatura, pH, presión, etc. El equilibrio entre los estados proteicos diferentes pero discretos, es decir, estado nativo, estados intermedios, estado desplegado, depende de el valor desnaturalizante; por lo tanto, la señal de fluorescencia global de su mezcla de equilibrio también depende de este valor. Se obtiene así un perfil que relaciona la señal proteica global con el valor desnaturalizante. El perfil del desarrollo del equilibrio puede permitirle a uno detectar e identificar los intermedios del desarrollo. [50] [51] Hugues Bedouelle ha desarrollado ecuaciones generales para obtener los parámetros termodinámicos que caracterizan los equilibrios de despliegue de proteínas homoméricas o heteroméricas, hasta trímeros y potencialmente tetrámeros, a partir de dichos perfiles. [48] La espectroscopia de fluorescencia se puede combinar con dispositivos de mezcla rápida, como el flujo detenido , para medir la cinética de plegamiento de proteínas, [52] generar un gráfico de chevron y obtener un análisis de valor Phi .

Dicroísmo circular

El dicroísmo circular es una de las herramientas más generales y básicas para estudiar el plegamiento de proteínas. La espectroscopia de dicroísmo circular mide la absorción de luz polarizada circularmente . En las proteínas, las estructuras como las hélices alfa y las láminas beta son quirales y, por tanto, absorben dicha luz. La absorción de esta luz actúa como un marcador del grado de plegamiento del conjunto de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para medir el despliegue en equilibrio de la proteína midiendo el cambio en esta absorción en función de la concentración de desnaturalizante o la temperatura . Una masa fundida desnaturalizante mide la energía libre de despliegue, así como el valor m de la proteína, o dependencia desnaturalizante. Una temperatura de fusión mide la temperatura de desnaturalización (Tm) de la proteína. [48] En cuanto a la espectroscopia de fluorescencia, la espectroscopia de dicroísmo circular se puede combinar con dispositivos de mezcla rápida como el flujo detenido para medir la cinética de plegamiento de proteínas y generar gráficos de chevron .

Dicroísmo circular vibratorio de proteínas.

Los desarrollos más recientes de las técnicas de dicroísmo circular vibracional (VCD) para proteínas, que actualmente involucran instrumentos de transformada de Fourier (FT), proporcionan un medio poderoso para determinar las conformaciones de proteínas en solución incluso para moléculas de proteínas muy grandes. Dichos estudios VCD de proteínas se pueden combinar con datos de difracción de rayos X para cristales de proteínas, datos FT-IR para soluciones de proteínas en agua pesada (D 2 O) o cálculos cuánticos .

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de proteínas

La resonancia magnética nuclear de proteínas (RMN) es capaz de recopilar datos estructurales de proteínas induciendo un campo magnético a través de muestras de proteína concentrada. En RMN , dependiendo del entorno químico, ciertos núcleos absorberán radiofrecuencias específicas. [53] [54] Debido a que los cambios estructurales de las proteínas operan en una escala de tiempo de ns a ms, la RMN está especialmente equipada para estudiar estructuras intermedias en escalas de tiempo de ps a s. [55] Algunas de las técnicas principales para estudiar la estructura de las proteínas y los cambios estructurales de las proteínas que no se pliegan incluyen COSY , TOCSY ,  HSQC , Relajación temporal (T1 y T2) y NOE . [53] La NOE es especialmente útil porque se pueden observar transferencias de magnetización entre hidrógenos espacialmente proximales. [53] Los diferentes experimentos de RMN tienen diversos grados de sensibilidad de escala de tiempo que son apropiados para diferentes cambios estructurales de proteínas. NOE puede captar vibraciones de unión o rotaciones de cadenas laterales, sin embargo, NOE es demasiado sensible para captar el plegado de proteínas porque ocurre en una escala de tiempo mayor. [55]

Escala de tiempo de los cambios estructurales de las proteínas emparejados con los experimentos de RMN. Para el plegamiento de proteínas, la dispersión de relajación de CPMG (CPMG RD) y la transferencia de saturación por intercambio químico (CEST) recopilan datos en la escala de tiempo adecuada.

Debido a que el plegamiento de proteínas tiene lugar en aproximadamente 50 a 3000 s −1 CPMG, la dispersión de relajación y la transferencia de saturación por intercambio químico se han convertido en algunas de las técnicas principales para el análisis de plegamiento por RMN. [54] Además, ambas técnicas se utilizan para descubrir estados intermedios excitados en el panorama del plegamiento de proteínas. [56] Para hacer esto, la dispersión de relajación CPMG aprovecha el fenómeno del eco de giro . Esta técnica expone los núcleos diana a un pulso de 90 seguido de uno o más pulsos de 180. [57] A medida que los núcleos se reenfocan, una distribución amplia indica que los núcleos diana están involucrados en un estado de excitación intermedio. Al observar los gráficos de dispersión de relajación, los datos recopilan información sobre la termodinámica y la cinética entre lo excitado y el suelo. [57] [56] La transferencia de saturación mide los cambios en la señal del estado fundamental a medida que los estados excitados se perturban. Utiliza una irradiación de radiofrecuencia débil para saturar el estado excitado de un núcleo particular que transfiere su saturación al estado fundamental. [54] Esta señal se amplifica al disminuir la magnetización (y la señal) del estado fundamental. [54] [56]

Las principales limitaciones en RMN es que su resolución disminuye con proteínas que son más grandes que 25 kDa y no es tan detallada como cristalografía de rayos X . [54] Además, el análisis de RMN de proteínas es bastante difícil y puede proponer múltiples soluciones del mismo espectro de RMN. [53]

En un estudio centrado en el plegamiento de una proteína SOD1 involucrada en la esclerosis lateral amiotrófica , se estudiaron intermedios excitados con dispersión de relajación y transferencia de saturación. [58] SOD1 se había vinculado previamente a muchos mutantes causantes de enfermedades que se suponía que estaban involucrados en la agregación de proteínas, sin embargo, el mecanismo aún era desconocido. Mediante el uso de experimentos de Dispersión de Relajación y Transferencia de Saturación, se descubrieron muchos estados intermedios excitados con plegamiento incorrecto en los mutantes SOD1. [58]

Interferometría de polarización dual

La interferometría de polarización dual es una técnica basada en la superficie para medir las propiedades ópticas de las capas moleculares. Cuando se utiliza para caracterizar el plegamiento de proteínas, mide la conformación determinando el tamaño total de una monocapa de la proteína y su densidad en tiempo real a una resolución sub-Angstrom, [59] aunque la medición en tiempo real de la cinética del plegamiento de proteínas es limitada a procesos que ocurren más lentos que ~ 10 Hz. Similar al dicroísmo circular , el estímulo para el plegamiento puede ser un desnaturalizante o la temperatura .

Estudios de plegado con alta resolución de tiempo

El estudio del plegamiento de proteínas ha avanzado mucho en los últimos años gracias al desarrollo de técnicas rápidas de resolución temporal. Los experimentadores activan rápidamente el plegado de una muestra de proteína desplegada y observan la dinámica resultante . Las técnicas rápidas en uso incluyen la dispersión de neutrones , [60] mezcla ultrarrápida de soluciones, métodos fotoquímicos y espectroscopía de salto de temperatura con láser . Entre los muchos científicos que han contribuido al desarrollo de estas técnicas se encuentran Jeremy Cook, Heinrich Roder, Harry Gray , Martin Gruebele , Brian Dyer, William Eaton, Sheena Radford , Chris Dobson , Alan Fersht , Bengt Nölting y Lars Konermann.

Proteólisis

La proteólisis se utiliza habitualmente para sondear la fracción desplegada en una amplia gama de condiciones de solución (p. Ej., Proteólisis paralela rápida (FASTpp) . [61] [62]

Espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Se han utilizado técnicas de molécula única, como pinzas ópticas y AFM, para comprender los mecanismos de plegamiento de proteínas de proteínas aisladas, así como proteínas con chaperonas. [63] Se han utilizado pinzas ópticas para estirar moléculas de proteína individuales desde sus extremos C y N y desplegarlas para permitir el estudio del replegamiento posterior. [64] La técnica permite medir las tasas de plegamiento a nivel de una sola molécula; por ejemplo, recientemente se han aplicado pinzas ópticas para estudiar el plegado y desplegado de proteínas implicadas en la coagulación de la sangre. El factor von Willebrand (vWF) es una proteína con un papel esencial en el proceso de formación de coágulos sanguíneos. Descubrió, utilizando la medición de pinzas ópticas de una sola molécula, que el vWF unido al calcio actúa como un sensor de fuerza de corte en la sangre. La fuerza de cizallamiento conduce al despliegue del dominio A2 del vWF, cuya velocidad de replegamiento aumenta drásticamente en presencia de calcio. [65] Recientemente, también se demostró que el dominio src SH3 simple accede a múltiples vías de despliegue en vigor. [66]

Pintura de biotina

La pintura con biotina permite obtener instantáneas celulares específicas de la condición de proteínas (no) plegadas. La "pintura" de biotina muestra un sesgo hacia las proteínas intrínsecamente desordenadas predichas . [67]

Los estudios computacionales del plegamiento de proteínas incluyen tres aspectos principales relacionados con la predicción de la estabilidad, cinética y estructura de las proteínas. Una revisión reciente resume los métodos computacionales disponibles para el plegamiento de proteínas. [68]

La paradoja de Levinthal

En 1969, Cyrus Levinthal señaló que, debido al gran número de grados de libertad en una cadena polipeptídica desplegada, la molécula tiene un número astronómico de posibles conformaciones. En uno de sus artículos se hizo una estimación de 3 300 o 10 143 . [69] La paradoja de Levinthal es un experimento mental basado en la observación de que si una proteína fuera plegada por muestreo secuencial de todas las conformaciones posibles, llevaría una cantidad astronómica de tiempo hacerlo, incluso si las conformaciones se muestrearan a un ritmo rápido ( en la escala de nanosegundos o picosegundos ). [70] Basándose en la observación de que las proteínas se pliegan mucho más rápido que esto, Levinthal propuso que no se produce una búsqueda conformacional aleatoria y, por lo tanto, la proteína debe doblarse a través de una serie de estados intermedios metaestables .

Paisaje energético del plegamiento de proteínas

El embudo de energía por el cual una cadena polipeptídica desplegada asume su estructura nativa.

El espacio de configuración de una proteína durante el plegado se puede visualizar como un paisaje energético . Según Joseph Bryngelson y Peter Wolynes , las proteínas siguen el principio de frustración mínima, lo que significa que las proteínas evolucionadas naturalmente han optimizado sus paisajes de energía de plegamiento, [71] y que la naturaleza ha elegido secuencias de aminoácidos para que el estado plegado de la proteína sea suficientemente estable. Además, la adquisición del estado plegado tenía que convertirse en un proceso suficientemente rápido. A pesar de que la naturaleza ha reducido el nivel de frustración en las proteínas, hasta ahora permanece cierto grado, como se puede observar en presencia de mínimos locales en el panorama energético de las proteínas.

Una consecuencia de estas secuencias seleccionadas evolutivamente es que generalmente se piensa que las proteínas tienen globalmente "paisajes energéticos canalizados" (acuñados por José Onuchic ) [72] que se dirigen en gran medida hacia el estado nativo. Este paisaje de " embudo de plegado " permite que la proteína se pliegue al estado nativo a través de cualquiera de una gran cantidad de vías e intermedios, en lugar de estar restringida a un solo mecanismo. La teoría está respaldada tanto por simulaciones computacionales de proteínas modelo como por estudios experimentales, [71] y se ha utilizado para mejorar los métodos de predicción y diseño de la estructura de las proteínas . [71] La descripción del plegamiento de proteínas por el paisaje nivelador de energía libre también es consistente con la segunda ley de la termodinámica. [73] Físicamente, pensar en paisajes en términos de potencial visualizable o superficies de energía total simplemente con máximos, puntos de silla, mínimos y embudos, como paisajes geográficos, es quizás un poco engañoso. La descripción relevante es realmente un espacio de fase de alta dimensión en el que las variedades pueden tomar una variedad de formas topológicas más complicadas. [74]

La cadena polipeptídica desplegada comienza en la parte superior del embudo donde puede asumir el mayor número de variaciones desplegadas y se encuentra en su estado de mayor energía. Paisajes energéticos como estos indican que hay una gran cantidad de posibilidades iniciales, pero solo un estado nativo es posible; sin embargo, no revela las numerosas vías de plegado que son posibles. Una molécula diferente de la misma proteína exacta puede seguir vías de plegamiento marginalmente diferentes, buscando diferentes intermedios de menor energía, siempre que se alcance la misma estructura nativa. [75] Diferentes vías pueden tener diferentes frecuencias de utilización dependiendo de la favorabilidad termodinámica de cada vía. Esto significa que si se encuentra que una vía es más favorable termodinámicamente que otra, es probable que se use con más frecuencia en la búsqueda de la estructura nativa. [75] A medida que la proteína comienza a plegarse y asumir sus diversas conformaciones, siempre busca una estructura termodinámicamente más favorable que antes y así continúa a través del embudo de energía. La formación de estructuras secundarias es una fuerte indicación de una mayor estabilidad dentro de la proteína, y solo una combinación de estructuras secundarias asumida por la estructura polipeptídica tendrá la energía más baja y, por lo tanto, estará presente en el estado nativo de la proteína. [75] Entre las primeras estructuras que se forman una vez que el polipéptido comienza a plegarse están las hélices alfa y las vueltas beta, donde las hélices alfa pueden formarse en tan solo 100 nanosegundos y las vueltas beta en 1 microsegundo. [28]

Existe un punto de silla en el panorama del embudo de energía donde se encuentra el estado de transición para una proteína en particular. [28] El estado de transición en el diagrama de embudo de energía es la conformación que debe asumir cada molécula de esa proteína si la proteína desea finalmente asumir la estructura nativa. Ninguna proteína puede asumir la estructura nativa sin pasar primero por el estado de transición. [28] Se puede hacer referencia al estado de transición como una variante o forma prematura del estado nativo en lugar de simplemente otro paso intermedio. [76] Se muestra que el plegado del estado de transición es determinante de la velocidad, y aunque existe en un estado de mayor energía que el plegado nativo, se parece mucho a la estructura nativa. Dentro del estado de transición, existe un núcleo alrededor del cual la proteína puede plegarse, formado por un proceso denominado "condensación por nucleación" donde la estructura comienza a colapsar sobre el núcleo. [76]

Modelado del plegamiento de proteínas

Folding @ home utiliza modelos de estado de Markov , como el que se muestra aquí, para modelar las posibles formas y vías de plegado que puede tomar una proteína a medida que se condensa desde su estado inicial enrollado aleatoriamente (izquierda) en su estructura 3D nativa (derecha).

Pueden usarsetécnicas de novo o ab initio para la predicción computacional de la estructura de proteínas para simular varios aspectos del plegamiento de proteínas. Se utilizó Molecular Dynamics (MD) en simulaciones de plegamiento y dinámica de proteínas in silico . [77] Las primeras simulaciones de plegado en equilibrio se realizaron utilizando un modelo de disolvente implícito y un muestreo de paraguas . [78] Debido al costo computacional, las simulaciones de plegamiento MD ab initio con agua explícita se limitan a péptidos y proteínas muy pequeñas. [79] [80] Las simulaciones MD de proteínas más grandes permanecen restringidas a la dinámica de la estructura experimental o su despliegue a alta temperatura. Se puede acceder a procesos de plegado de larga duración (más allá de aproximadamente 1 milisegundo), como el plegado de proteínas de tamaño pequeño (aproximadamente 50 residuos) o más grandes, utilizando modelos de grano grueso . [81] [82] [83]

Varios proyectos computacionales a gran escala, como Rosetta @ home , [84] Folding @ home [85] y Foldit , [86] diana el plegamiento de proteínas.

Se han realizado simulaciones de larga trayectoria continua en Anton , una supercomputadora masivamente paralela diseñada y construida alrededor de ASIC personalizados e interconexiones por DE Shaw Research . El resultado más largo publicado de una simulación realizada con Anton es una simulación de 2.936 milisegundos de NTL9 a 355 K. [87]

  • Parcela de Chevron
  • Punto medio de desnaturalización
  • Plegado cuesta abajo
  • Plegable (química)
  • Análisis del valor de phi
  • Energía potencial de las proteínas
  • Dinámica proteica
  • Amplificación cíclica de plegamiento incorrecto de proteínas
  • Software de predicción de la estructura de proteínas
  • Proteopatía
  • Espectrometría de masas resuelta en el tiempo

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  • Proyecto de plegado del proteoma humano