La replicación del ADN eucariota es un mecanismo conservado que restringe la replicación del ADN a una vez por ciclo celular. La replicación del ADN eucariótico de cromosómica de ADN es central para la duplicación de una célula y es necesario para el mantenimiento de la eucariota genoma .
La replicación del ADN es la acción de las ADN polimerasas que sintetizan una hebra de ADN complementaria a la hebra molde original. Para sintetizar el ADN, las helicasas de ADN desenrollan el ADN de doble hebra antes que las polimerasas, formando una horquilla de replicación que contiene dos moldes de hebra sencilla. Los procesos de replicación permiten copiar una única doble hélice de ADN en dos hélices de ADN, que se dividen en células hijas en la mitosis . Las principales funciones enzimáticas llevadas a cabo en la bifurcación de replicación están bien conservadas desde procariotas hasta eucariotas., pero la maquinaria de replicación en la replicación del ADN eucariota es un complejo mucho más grande, que coordina muchas proteínas en el sitio de replicación, formando el replisoma . [1]
El replisoma es responsable de copiar la totalidad del ADN genómico en cada célula proliferativa. Este proceso permite el paso de alta fidelidad de información genética / hereditaria de la célula parental a la célula hija y, por tanto, es esencial para todos los organismos. Gran parte del ciclo celular se basa en garantizar que la replicación del ADN se produzca sin errores. [1]
En la fase G 1 del ciclo celular, se inician muchos de los procesos reguladores de la replicación del ADN. En eucariotas, la gran mayoría de la síntesis de ADN ocurre durante la fase S del ciclo celular, y el genoma completo debe desenrollarse y duplicarse para formar dos copias hijas. Durante G 2 , se corrige cualquier ADN dañado o errores de replicación. Finalmente, una copia de los genomas se segrega a cada célula hija en la mitosis o fase M. [2] Cada una de estas copias hijas contiene una hebra del ADN dúplex parental y una hebra antiparalela naciente.
Este mecanismo se conserva de procariotas a eucariotas y se conoce como replicación del ADN semiconservativo . El proceso de replicación semiconservativa para el sitio de replicación del ADN es una estructura de ADN en forma de horquilla, la horquilla de replicación, donde la hélice de ADN está abierta o desenrollada, exponiendo nucleótidos de ADN no apareados para reconocimiento y apareamiento de bases para la incorporación de nucleótidos libres en doble -adn trenzado. [3]
Iniciación
El inicio de la replicación del ADN eucariótico es la primera etapa de la síntesis de ADN donde se desenrolla la doble hélice del ADN y se produce un evento de cebado inicial por la ADN polimerasa α en la cadena principal. El evento de cebado en la hebra rezagada establece una bifurcación de replicación. El cebado de la hélice de ADN consiste en la síntesis de un cebador de ARN para permitir la síntesis de ADN por la ADN polimerasa α. El cebado se produce una vez en el origen de la hebra principal y al comienzo de cada fragmento de Okazaki en la hebra rezagada.
La replicación del ADN se inicia a partir de secuencias específicas llamadas orígenes de replicación , y las células eucariotas tienen múltiples orígenes de replicación. Para iniciar la replicación del ADN, múltiples proteínas replicativas se ensamblan y se disocian de estos orígenes replicativos. [4] Los factores individuales descritos a continuación trabajan juntos para dirigir la formación del complejo de pre-replicación (pre-RC), un intermedio clave en el proceso de iniciación de la replicación.
La asociación del complejo de reconocimiento de origen (ORC) con un origen de replicación recluta la proteína del ciclo 6 de división celular (Cdc6) para formar una plataforma para la carga de las proteínas del complejo de mantenimiento de minicromosomas (Mcm 2-7) , facilitada por la licencia de cromatina y el ADN. proteína del factor de replicación 1 (Cdt1). El ORC, Cdc6 y Cdt1 juntos son necesarios para la asociación estable del complejo Mcm2-7 con orígenes replicativos durante la fase G 1 del ciclo celular. [5]
Complejo pre-replicativo
Los orígenes de replicación eucariotas controlan la formación de una serie de complejos de proteínas que conducen al ensamblaje de dos horquillas de replicación de ADN bidireccionales. Estos eventos son iniciados por la formación del complejo de pre-replicación (pre-RC) en los orígenes de la replicación. Este proceso tiene lugar en la etapa G 1 del ciclo celular. La formación pre-RC implica el ensamblaje ordenado de muchos factores de replicación, incluido el complejo de reconocimiento de origen (ORC), proteína Cdc6, proteína Cdt1 y proteínas de mantenimiento de minicromosomas (Mcm2-7). [6] [7] Una vez que se forma el pre-RC, la activación del complejo es desencadenada por dos quinasas , la quinasa 2 dependiente de ciclina (CDK) y la quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) que ayudan en la transición del pre-RC al inicio. complejo antes del inicio de la replicación del ADN. Esta transición implica el ensamblaje ordenado de factores de replicación adicionales para desenrollar el ADN y acumular las múltiples ADN polimerasas eucarióticas alrededor del ADN desenrollado. Un aspecto central de la cuestión de cómo se establecen las bifurcaciones de replicación bidireccional en los orígenes de replicación es el mecanismo mediante el cual ORC recluta dos complejos Mcm2-7 de cabeza a cabeza en cada origen de replicación para formar el complejo de pre-replicación. [8] [9] [10]
Complejo de reconocimiento de origen
El primer paso en el ensamblaje del complejo de pre-replicación (pre-RC) es la unión del complejo de reconocimiento de origen (ORC) al origen de replicación. En la mitosis tardía, la proteína Cdc6 se une al ORC unido seguido de la unión del complejo Cdt1-Mcm2-7. [11] Se requieren ORC, Cdc6 y Cdt1 para cargar el complejo de mantenimiento de seis minicromosomas de proteínas (Mcm 2-7) en el ADN. El ORC es un complejo proteico de seis subunidades, Orc1p-6, que selecciona los sitios de origen replicativo en el ADN para el inicio de la replicación y la unión del ORC a la cromatina se regula a través del ciclo celular. [6] [12] Generalmente, la función y el tamaño de las subunidades ORC se conservan en muchos genomas eucariotas, con la diferencia de que sus sitios de unión de ADN divergentes.
El complejo de reconocimiento de origen más estudiado es el de Saccharomyces cerevisiae o levadura que se sabe que se une a la secuencia de replicación autónoma (ARS). [13] El ORC de S. cerevisiae interactúa específicamente con los elementos A y B1 de los orígenes de replicación de la levadura, abarcando una región de 30 pares de bases . [14] La unión a estas secuencias requiere ATP . [6] [14]
Se ha determinado la estructura atómica del ORC de S. cerevisiae unido al ADN del ARS. [14] Orc1, Orc2, Orc3, Orc4 y Orc5 rodean el elemento A por medio de dos tipos de interacciones, la base no específica y la base específica, que doblan el ADN en el elemento A. Las cinco subunidades contactan con la columna vertebral de fosfato de azúcar en múltiples puntos del elemento A para formar un agarre firme sin especificidad de base. Orc1 y Orc2 contactan con el surco menor del elemento A, mientras que un dominio de hélice alada de Orc4 contacta con los grupos metilo de los invariantes Ts en el surco mayor del elemento A a través de una hélice de inserción (IH). La ausencia de este IH en los metazoos [14] explica la falta de especificidad de secuencia en el ORC humano. [15] [16] El ADN del ARS también se dobla en el elemento B1 a través de interacciones con Orc2, Orc5 y Orc6. [14] La flexión del ADN de origen por ORC parece conservarse evolutivamente, lo que sugiere que puede ser necesaria para el mecanismo de carga del complejo Mcm2-7. [14] [17]
Cuando el ORC se une al ADN en los orígenes de la replicación, sirve como un andamio para el ensamblaje de otros factores clave de iniciación del complejo prerreplicativo. [18] Este conjunto complejo pre-replicativo durante la etapa G 1 del ciclo celular es necesario antes de la activación de la replicación del ADN durante la fase S. [19] La eliminación de al menos parte del complejo (Orc1) del cromosoma en la metafase es parte de la regulación de la ORC de mamíferos para garantizar que se elimine la formación del complejo prerreplicativo antes de la finalización de la metafase. [20]
Proteína Cdc6
La unión de la proteína del ciclo de división celular 6 (Cdc6) al complejo de reconocimiento de origen (ORC) es un paso esencial en el ensamblaje del complejo de prerreplicación (pre-RC) en los orígenes de la replicación. Cdc6 se une al ORC en el ADN de una manera dependiente de ATP, lo que induce un cambio en el patrón de unión de origen que requiere ATPasa Orc1 . [21] Cdc6 requiere ORC para asociarse con la cromatina y, a su vez, es necesario para que el heptámero Cdt1-Mcm2-7 [11] se una a la cromatina. [22] El complejo ORC-Cdc6 forma una estructura en forma de anillo y es análogo a otras máquinas de proteínas dependientes de ATP. Los niveles y la actividad de Cdc6 regulan la frecuencia con la que se utilizan los orígenes de la replicación durante el ciclo celular.
Proteína Cdt1
La proteína de autorización de cromatina y factor de replicación de ADN 1 (Cdt1) es necesaria para la autorización de cromatina para la replicación de ADN. [23] [24] En S. cerevisiae , Cdt1 facilita la carga del complejo Mcm2-7 de uno en uno en el cromosoma al estabilizar la estructura de anillo abierto zurdo del hexámero único Mcm2-7. [11] [25] [26] Se ha demostrado que Cdt1 se asocia con el extremo C de Cdc6 para promover cooperativamente la asociación de proteínas Mcm a la cromatina. [27] La estructura crio-EM del complejo OCCM (ORC-Cdc6-Cdt1-MCM) muestra que el Cdt1-CTD interactúa con el Mcm6-WHD. [28] En los metazoos, la actividad de Cdt1 durante el ciclo celular está estrechamente regulada por su asociación con la proteína geminina , que inhibe la actividad de Cdt1 durante la fase S para evitar la replicación del ADN y evita la ubiquitinación y la proteólisis posterior . [29]
Complejo proteico de mantenimiento de minicromosomas
Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas (Mcm) recibieron el nombre de un cribado genético de mutantes de iniciación de la replicación del ADN en S. cerevisiae que afectan la estabilidad del plásmido de una manera específica de ARS . [30] Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6 y Mcm7 forman un complejo hexámero que tiene una estructura de anillo abierto con un espacio entre Mcm2 y Mcm5. [11] El ensamblaje de las proteínas Mcm en cromatina requiere la función coordinada del complejo de reconocimiento de origen (ORC), Cdc6 y Cdt1. [31] Una vez que las proteínas Mcm se han cargado en la cromatina, el ORC y el Cdc6 se pueden eliminar de la cromatina sin evitar la replicación posterior del ADN. Esta observación sugiere que el papel principal del complejo de pre-replicación es cargar correctamente las proteínas Mcm. [32]
Las proteínas Mcm en la cromatina forman un hexámero doble cabeza a cabeza con los dos anillos ligeramente inclinados, retorcidos y descentrados para crear un nudo en el canal central donde el ADN unido se captura en la interfaz de los dos anillos. [33] [34] Cada anillo hexamérico Mcm2-7 sirve primero como andamio para el ensamblaje del replisoma y luego como núcleo de la helicasa catalítica CMG (Cdc45-MCM-GINS), que es un componente principal del replisoma. Cada proteína Mcm está altamente relacionada con todas las demás, pero las secuencias únicas que distinguen cada uno de los tipos de subunidades se conservan en los eucariotas. Todos los eucariotas tienen exactamente seis análogos de proteínas Mcm, cada uno de los cuales pertenece a una de las clases existentes (Mcm2-7), lo que indica que cada proteína Mcm tiene una función única e importante. [35] [9]
Las proteínas de mantenimiento de los minicromosomas son necesarias para la actividad de la ADN helicasa. La inactivación de cualquiera de las seis proteínas Mcm durante la fase S evita una mayor progresión de la horquilla de replicación, lo que sugiere que la helicasa no puede reciclarse y debe ensamblarse en los orígenes de replicación. [36] Junto con la actividad helicasa del complejo proteico de mantenimiento de minicromosomas, el complejo también tiene actividad ATPasa asociada. [37] Una mutación en cualquiera de las seis proteínas Mcm reduce los sitios de unión de ATP conservados, lo que indica que la hidrólisis de ATP es un evento coordinado que involucra a las seis subunidades del complejo Mcm. [38] Los estudios han demostrado que dentro del complejo de proteínas Mcm hay pares catalíticos específicos de proteínas Mcm que funcionan juntas para coordinar la hidrólisis de ATP. Por ejemplo, Mcm3 pero no Mcm6 puede activar la actividad de Mcm6. Estos estudios, confirmados por las estructuras crio-EM de los complejos Mcm2-7, [11] [33] sugieren que el complejo Mcm es un hexámero con Mcm3 junto a Mcm7 , Mcm2 junto a Mcm6 y Mcm4 junto a Mcm5 . Ambos miembros del par catalítico contribuyen a la conformación que permite la unión e hidrólisis de ATP y la mezcla de subunidades activas e inactivas crea una actividad de ATPasa coordinada que permite que el complejo proteico Mcm complete la unión e hidrólisis de ATP como un todo. [39]
La localización nuclear de las proteínas de mantenimiento del minicromosoma está regulada en las células de levadura en ciernes. [40] [41] Las proteínas Mcm están presentes en el núcleo en la etapa G 1 y la fase S del ciclo celular, pero se exportan al citoplasma durante la etapa G 2 y la fase M. Se requiere un complejo Mcm de seis subunidades completo e intacto para entrar en el núcleo celular. [42] En S. cerevisiae , la exportación nuclear es promovida por la actividad quinasa dependiente de ciclina (CDK). Las proteínas Mcm que están asociadas con la cromatina están protegidas de la maquinaria de exportación de CDK debido a la falta de accesibilidad a la CDK. [43]
Complejo de iniciación
Durante la etapa G 1 del ciclo celular, los factores de iniciación de la replicación, el complejo de reconocimiento de origen (ORC), Cdc6, Cdt1 y el complejo proteico de mantenimiento de minicromosomas (Mcm), se unen secuencialmente al ADN para formar el complejo de pre-replicación (pre-RC ). En la transición de la etapa G 1 a la fase S del ciclo celular, la proteína quinasa dependiente de ciclina específica de la fase S (CDK) y la quinasa Cdc7 / Dbf4 (DDK) transforman la pre-RC en una horquilla de replicación activa. Durante esta transformación, el pre-RC se desmonta con la pérdida de Cdc6, creando el complejo de iniciación. Además de la unión de las proteínas Mcm, la proteína del ciclo de división celular 45 (Cdc45) también es esencial para iniciar la replicación del ADN. [44] [45] Los estudios han demostrado que Mcm es fundamental para la carga de Cdc45 en la cromatina y este complejo que contiene tanto Mcm como Cdc45 se forma al inicio de la fase S del ciclo celular. [46] [47] Cdc45 se dirige al complejo proteico Mcm, que se ha cargado en la cromatina, como un componente del pre-RC en el origen de la replicación durante la etapa G 1 del ciclo celular. [48]
Proteína Cdc45
La proteína del ciclo de división celular 45 (Cdc45) es un componente crítico para la conversión del complejo pre-replicativo en el complejo de iniciación. La proteína Cdc45 se ensambla en los orígenes de replicación antes de la iniciación y es necesaria para que la replicación comience en Saccharomyces cerevisiae , y tiene un papel esencial durante el alargamiento. Por tanto, Cdc45 tiene funciones centrales tanto en las fases de iniciación como de elongación de la replicación del ADN cromosómico. [49]
Cdc45 se asocia con la cromatina después del comienzo de la iniciación en la etapa tardía G 1 y durante la fase S del ciclo celular. Cdc45 se asocia físicamente con Mcm5 y muestra interacciones genéticas con cinco de los seis miembros de la familia de genes Mcm y el gen ORC2 . [50] [48] La carga de Cdc45 en la cromatina es fundamental para cargar otras proteínas de replicación diversas, incluida la ADN polimerasa α , la ADN polimerasa ε, la proteína de replicación A (RPA) y el antígeno nuclear celular en proliferación (PCNA) en la cromatina. [47] [51] [52] [53] Dentro de un sistema sin núcleo de Xenopus , se ha demostrado que se requiere Cdc45 para desenrollar el ADN plasmídico. [53] El sistema sin núcleo de Xenopus también demuestra que el desenrollamiento del ADN y la unión estrecha del RPA a la cromatina se produce solo en presencia de Cdc45. [47]
La unión de Cdc45 a la cromatina depende de la actividad de la quinasa Clb-Cdc28, así como de la Cdc6 y Mcm2 funcionales, lo que sugiere que Cdc45 se asocia con la pre-RC después de la activación de las quinasas dependientes de ciclina (CDK) en fase S. Según lo indicado por el tiempo y la dependencia de CDK, la unión de Cdc45 a la cromatina es crucial para el compromiso con el inicio de la replicación del ADN. Durante la fase S, Cdc45 interactúa físicamente con las proteínas Mcm en la cromatina; sin embargo, la disociación de Cdc45 de la cromatina es más lenta que la de Mcm, lo que indica que las proteínas se liberan por diferentes mecanismos. [35]
Ginebra
Las seis proteínas de mantenimiento de los minicromosomas y Cdc45 son esenciales durante la iniciación y elongación para el movimiento de las horquillas de replicación y para el desenrollamiento del ADN. Los GINS son esenciales para la interacción de Mcm y Cdc45 en los orígenes de la replicación durante la iniciación y luego en las horquillas de replicación del ADN a medida que avanza el replisoma. [54] [55] El complejo GINS está compuesto por cuatro proteínas pequeñas Sld5 (Cdc105), Psf1 (Cdc101), Psf2 (Cdc102) y Psf3 (Cdc103), GINS representa 'go, ichi, ni, san' que significa '5 , 1, 2, 3 'en japonés. [56] Cdc45, Mcm2-7 y GINS juntos forman la helicasa CMG, [57] la helicasa replicativa del replisoma. Aunque el complejo Mcm2-7 solo tiene una actividad helicasa débil [58] Cdc45 y GINS son necesarios para una actividad helicasa sólida [59] [60]
Mcm10
Mcm10 es esencial para la replicación cromosómica e interactúa con la helicasa 2-7 de mantenimiento del minicromosoma que se carga en forma inactiva en los orígenes de la replicación del ADN. [61] [62] Mcm10 también acompaña a la ADN polimerasa α catalítica y ayuda a estabilizar la polimerasa en las horquillas de replicación. [63] [64]
Quinasas DDK y CDK
Al inicio de la fase S, el complejo pre-replicativo debe ser activado por dos quinasas específicas de la fase S para formar un complejo de iniciación en un origen de replicación. Una quinasa es la quinasa Cdc7-Dbf4 llamada quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) y la otra es la quinasa dependiente de ciclina (CDK). [65] Los ensayos de unión a cromatina de Cdc45 en levadura y Xenopus han demostrado que un evento posterior de la acción de CDK es la carga de Cdc45 en cromatina. [45] [46] Se ha especulado que Cdc6 es un objetivo de la acción de CDK, debido a la asociación entre Cdc6 y CDK, y la fosforilación de Cdc6 dependiente de CDK . Se ha considerado que la fosforilación de Cdc6 dependiente de CDK es necesaria para entrar en la fase S. [66]
Tanto las subunidades catalíticas de DDK, Cdc7, como la proteína activadora, Dbf4, se conservan en eucariotas y son necesarias para el inicio de la fase S del ciclo celular. [67] [68] Tanto DDK como Cdc7 son necesarios para la carga de Cdc45 en los orígenes de replicación de la cromatina. El objetivo para la unión de la cinasa DDK es el complejo Mcm, posiblemente Mcm2. [69] [67] DDK se dirige al complejo Mcm y su fosforilación conduce a la posible activación de la actividad helicasa de Mcm. [70]
Proteínas Dpb11, Sld3 y Sld2
Sld3, Sld2 y Dpb11 interactúan con muchas proteínas de replicación. Sld3 y Cdc45 forman un complejo que se asoció con el pre-RC en los orígenes tempranos de replicación incluso en la fase G1 1 y con los orígenes posteriores de replicación en la fase S de una manera mutuamente dependiente de Mcm. [71] [72] Dpb11 y Sld2 interactúan con la polimerasa ɛ y los experimentos de entrecruzamiento han indicado que Dpb11 y polimerasa ɛ coprecipitan en la fase S y se asocian con los orígenes de replicación. [73] [74]
Sld3 y Sld2 son fosforilados por CDK, lo que permite que las dos proteínas replicativas se unan a Dpb11. Dpb11 tenía dos pares de dominios BRCA1 C Terminus (BRCT) que se conocen como dominios de unión a fosfopéptidos. [75] El par N-terminal de los dominios BRCT se une a Sld3 fosforilado, y el par C-terminal se une a Sld2 fosforilado. Ambas interacciones son esenciales para la activación dependiente de CDK de la gemación del ADN en la levadura. [76]
Dpb11 también interactúa con GINS y participa en los pasos de iniciación y alargamiento de la replicación del ADN cromosómico. [55] [77] [78] Las GINS son una de las proteínas de replicación que se encuentran en las horquillas de replicación y forman un complejo con Cdc45 y Mcm.
Estas interacciones dependientes de la fosforilación entre Dpb11, Sld2 y Sld3 son esenciales para la activación de la replicación del ADN dependiente de CDK y, mediante el uso de reactivos de entrecruzamiento en algunos experimentos, se identificó un complejo frágil llamado complejo de precarga (pre-LC) . Este complejo contiene Pol ɛ, GINS, Sld2 y Dpb11. Se encuentra que el pre-LC se forma antes de cualquier asociación con los orígenes de una manera dependiente de CDK y dependiente de DDK y la actividad de CDK regula el inicio de la replicación del ADN a través de la formación del pre-LC. [79]
Alargamiento
La formación del complejo pre-replicativo (pre-RC) marca los sitios potenciales para el inicio de la replicación del ADN. De acuerdo con el complejo de mantenimiento de minicromosomas que rodea al ADN de doble hebra, la formación del pre-RC no conduce al desenrollamiento inmediato del ADN de origen ni al reclutamiento de ADN polimerasas. En cambio, el pre-RC que se forma durante el G 1 del ciclo celular solo se activa para desenrollar el ADN e iniciar la replicación después de que las células pasan de la fase G 1 a la S del ciclo celular. [2]
Una vez que se forma el complejo de iniciación y las células pasan a la fase S, el complejo se vuelve replisoma. El complejo de replisoma eucariota es responsable de coordinar la replicación del ADN. La replicación en las hebras anterior y posterior se realiza mediante la ADN polimerasa ε y la ADN polimerasa δ. Muchos factores replisomas, incluidos Claspin, And1, factor de replicación C clamp loader y el complejo de protección de la horquilla, son responsables de regular las funciones de la polimerasa y coordinar la síntesis de ADN con el desenrollamiento de la hebra molde por el complejo Cdc45-Mcm-GINS. A medida que se desenrolla el ADN, el número de torsiones disminuye. Para compensar esto, el número de retorcimientos aumenta, introduciendo superenrollamientos positivos en el ADN. Estos superenrollamientos harían que la replicación del ADN se detuviera si no se eliminaran. Las topoisomerasas son responsables de eliminar estas superenrollamientos antes de la bifurcación de replicación.
El replisoma es responsable de copiar todo el ADN genómico en cada célula proliferativa. Las reacciones de apareamiento de bases y formación de cadenas, que forman la hélice hija, son catalizadas por ADN polimerasas. [80] Estas enzimas se mueven a lo largo del ADN monocatenario y permiten la extensión de la cadena de ADN naciente "leyendo" la cadena molde y permitiendo la incorporación de las nucleobases de purina adecuadas , adenina y guanina , y nucleobases de pirimidina , timina y citosina . Los desoxirribonucleótidos libres activados existen en la célula como desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP). Estos nucleótidos libres se añaden a un grupo 3'-hidroxilo expuesto en el último nucleótido incorporado. En esta reacción, se libera un pirofosfato del dNTP libre, generando energía para la reacción de polimerización y exponiendo el monofosfato 5 ', que luego se une covalentemente al oxígeno 3'. Además, los nucleótidos insertados incorrectamente se pueden eliminar y reemplazar por los nucleótidos correctos en una reacción energéticamente favorable. Esta propiedad es vital para la corrección de pruebas y la reparación adecuadas de los errores que ocurren durante la replicación del ADN.
Bifurcación de replicación
La bifurcación de replicación es la unión entre las hebras de plantilla recién separadas, conocidas como hebras principales y rezagadas, y el ADN de doble hebra. Dado que el ADN dúplex es antiparalelo, la replicación del ADN se produce en direcciones opuestas entre las dos nuevas hebras en la bifurcación de replicación, pero todas las ADN polimerasas sintetizan ADN en la dirección 5 'a 3' con respecto a la hebra recién sintetizada. Se requiere una mayor coordinación durante la replicación del ADN. Dos polimerasas replicativas sintetizan ADN en orientaciones opuestas. La polimerasa ε sintetiza ADN en la cadena de ADN "principal" de forma continua, ya que apunta en la misma dirección que el ADN desenrollado por el replisoma. Por el contrario, la polimerasa δ sintetiza ADN en la hebra "retrasada", que es la hebra de plantilla de ADN opuesta, de manera fragmentada o discontinua.
Los tramos discontinuos de los productos de replicación del ADN en la hebra rezagada se conocen como fragmentos de Okazaki y tienen una longitud de aproximadamente 100 a 200 bases en las horquillas de replicación eucariotas. La hebra rezagada generalmente contiene tramos más largos de ADN monocatenario que está recubierto con proteínas de unión monocatenarias, que ayudan a estabilizar las plantillas monocatenarias evitando la formación de una estructura secundaria. En eucariotas, estas proteínas de unión monocatenarias son un complejo heterotrimérico conocido como proteína de replicación A (RPA). [81]
Cada fragmento de Okazaki está precedido por un cebador de ARN, que es desplazado por la procesión del siguiente fragmento de Okazaki durante la síntesis. La ARNasa H reconoce los híbridos ADN: ARN que se crean mediante el uso de cebadores de ARN y es responsable de eliminarlos de la hebra replicada, dejando una unión cebador: molde. La ADN polimerasa α reconoce estos sitios y alarga las roturas dejadas por la eliminación del cebador. En las células eucariotas, también se desplaza una pequeña cantidad del segmento de ADN inmediatamente aguas arriba del cebador de ARN, creando una estructura de aleta. Este colgajo es luego escindido por endonucleasas. En la horquilla de replicación, la brecha en el ADN después de la extracción del colgajo se sella con ADN ligasa I , que repara las mellas que quedan entre el 3'-OH y el 5'fosfato de la hebra recién sintetizada. [82] Debido a la naturaleza relativamente corta del fragmento eucariótico de Okazaki, la síntesis de replicación del ADN que se produce de forma discontinua en la hebra rezagada es menos eficiente y requiere más tiempo que la síntesis de la hebra principal. La síntesis de ADN se completa una vez que se eliminan todos los cebadores de ARN y se reparan las mellas.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/0/0a/Replication_fork.svg/290px-Replication_fork.svg.png)
Filamento principal
Durante la replicación del ADN, el replisoma desenrollará el ADN dúplex parental en una bifurcación de replicación de la plantilla de ADN de dos hebras en una dirección de 5 'a 3'. La hebra principal es la hebra de plantilla que se replica en la misma dirección que el movimiento de la horquilla de replicación. Esto permite que la hebra recién sintetizada complementaria a la hebra original se sintetice de 5 'a 3' en la misma dirección que el movimiento de la horquilla de replicación. [83]
Una vez que una primasa ha agregado un cebador de ARN al extremo 3 'de la cadena principal, la síntesis de ADN continuará en una dirección de 3' a 5 'con respecto a la cadena principal sin interrupciones. La ADN polimerasa ε agregará continuamente nucleótidos a la hebra molde, por lo que la síntesis de la hebra principal requiere solo un cebador y tiene actividad de ADN polimerasa ininterrumpida. [84]
Hebra rezagada
La replicación del ADN en la hebra rezagada es discontinua. En la síntesis de hebras rezagadas, el movimiento de la ADN polimerasa en la dirección opuesta a la horquilla de replicación requiere el uso de múltiples cebadores de ARN . La ADN polimerasa sintetizará fragmentos cortos de ADN llamados fragmentos de Okazaki que se añaden al extremo 3 'del cebador. Estos fragmentos pueden tener entre 100 y 400 nucleótidos de longitud en eucariotas. [85]
Al final de la síntesis del fragmento de Okazaki, la ADN polimerasa δ se encuentra con el fragmento de Okazaki anterior y desplaza su extremo 5 'que contiene el cebador de ARN y un pequeño segmento de ADN. Esto genera un colgajo de una sola hebra de ARN-ADN, que debe escindirse, y la muesca entre los dos fragmentos de Okazaki debe sellarse con ADN ligasa I. Este proceso se conoce como maduración de fragmentos de Okazaki y se puede manejar de dos maneras: procesos de un mecanismo colgajos cortos, mientras que el otro se ocupa de colgajos largos. [86] La ADN polimerasa δ es capaz de desplazar de 2 a 3 nucleótidos de ADN o ARN antes de su polimerización, generando un sustrato corto de "solapa" para Fen1 , que puede eliminar nucleótidos de la solapa, un nucleótido a la vez.
Al repetir los ciclos de este proceso, la ADN polimerasa δ y Fen1 pueden coordinar la eliminación de los cebadores de ARN y dejar una muesca de ADN en la hebra rezagada. [87] Se ha propuesto que este proceso iterativo es preferible al de la célula porque está estrictamente regulado y no genera grandes colgajos que deban extirparse. [88] En caso de actividad desregulada de Fen1 / ADN polimerasa δ, la célula utiliza un mecanismo alternativo para generar y procesar colgajos largos mediante el uso de Dna2, que tiene actividades tanto helicasa como nucleasa. [89] La actividad nucleasa de Dna2 es necesaria para eliminar estos colgajos largos, dejando un colgajo más corto para ser procesado por Fen1. Los estudios de microscopía electrónica indican que la carga de nucleosomas en la hebra rezagada ocurre muy cerca del sitio de síntesis. [90] Por lo tanto, la maduración del fragmento de Okazaki es un proceso eficiente que ocurre inmediatamente después de que se sintetiza el ADN naciente.
ADN polimerasas replicativas
Una vez que la helicasa replicativa ha desenrollado el dúplex de ADN parental, exponiendo dos moldes de ADN monocatenario, se necesitan polimerasas replicativas para generar dos copias del genoma parental. La función de la ADN polimerasa es altamente especializada y logra la replicación en moldes específicos y en localizaciones estrechas. En la bifurcación de replicación eucariota, hay tres complejos de polimerasa replicativa distintos que contribuyen a la replicación del ADN: polimerasa α, polimerasa δ y polimerasa ε. Estas tres polimerasas son esenciales para la viabilidad de la célula. [91]
Debido a que las ADN polimerasas requieren un cebador sobre el cual comenzar la síntesis de ADN, la polimerasa α (Pol α) actúa como una primasa replicativa. Pol α está asociado con una ARN primasa y este complejo realiza la tarea de cebado sintetizando un cebador que contiene un tramo corto de 10 nucleótidos de ARN seguido de 10 a 20 bases de ADN. [3] Es importante destacar que esta acción de cebado ocurre en el inicio de la replicación en los orígenes para comenzar la síntesis de la hebra principal y también en el extremo 5 'de cada fragmento de Okazaki en la hebra rezagada.
Sin embargo, Pol α no puede continuar la replicación del ADN y debe reemplazarse con otra polimerasa para continuar la síntesis de ADN. [92] El cambio de polimerasa requiere cargadores de pinza y se ha demostrado que la replicación normal del ADN requiere las acciones coordinadas de las tres ADN polimerasas: Pol α para la síntesis de cebado, Pol ε para la replicación de la cadena principal y Pol δ, que se carga constantemente , para generar fragmentos de Okazaki durante la síntesis de hebras rezagadas. [93]
- Polimerasa α (Pol α) : forma un complejo con una subunidad catalítica pequeña (PriS) y una subunidad no catalítica grande (PriL). [94] En primer lugar, la síntesis de un cebador de ARN permite la síntesis de ADN mediante la ADN polimerasa alfa. Ocurre una vez en el origen de la hebra principal y al comienzo de cada fragmento de Okazaki en la hebra retrasada. Las subunidades Pri actúan como una primasa, sintetizando un cebador de ARN. DNA Pol α alarga el cebador recién formado con nucleótidos de DNA. Después de alrededor de 20 nucleótidos, Pol ε se hace cargo del alargamiento en la cadena principal y Pol δ en la cadena retrasada. [95]
- Polimerasa δ (Pol δ) : Altamente procesiva y con corrección de pruebas, actividad exonucleasa 3 '-> 5'. In vivo, que es la principal polimerasa implicada en tanto filamento de revestimiento y la síntesis de filamento principal. [96]
- Polimerasa ε (Pol ε) : altamente procesiva y tiene actividad de exonucleasa 3 '-> 5' de corrección de pruebas. Altamente relacionado con pol δ, in vivo funciona principalmente en la verificación de errores de pol δ. [96]
Complejo de helicasa Cdc45 – Mcm – GINS
Las ADN helicasas y polimerasas deben permanecer en estrecho contacto en la bifurcación de replicación. Si el desenrollamiento ocurre demasiado antes de la síntesis, se exponen grandes extensiones de ADN monocatenario. Esto puede activar la señalización del daño del ADN o inducir procesos de reparación del ADN. Para frustrar estos problemas, el replisoma eucariota contiene proteínas especializadas que están diseñadas para regular la actividad helicasa antes de la horquilla de replicación. Estas proteínas también proporcionan sitios de acoplamiento para la interacción física entre helicasas y polimerasas, asegurando así que el desenrollamiento dúplex se acople con la síntesis de ADN. [97]
Para que las ADN polimerasas funcionen, la hélice de ADN de doble hebra debe desenrollarse para exponer dos moldes de ADN de hebra sencilla para la replicación. Las helicasas de ADN son responsables de desenrollar el ADN de doble hebra durante la replicación cromosómica. Las helicasas en las células eucariotas son notablemente complejas. [98] El núcleo catalítico de la helicasa está compuesto por seis proteínas de mantenimiento de minicromosomas (Mcm2-7), que forman un anillo hexamérico . Lejos del ADN, las proteínas Mcm2-7 forman un solo heterohexámero y se cargan en una forma inactiva en los orígenes de la replicación del ADN como un doble hexámero cabeza a cabeza alrededor del ADN de doble hebra. [98] [99] Las proteínas Mcm se reclutan hasta los orígenes de replicación y luego se redistribuyen por todo el ADN genómico durante la fase S, lo que indica su localización en la horquilla de replicación. [48]
La carga de proteínas Mcm solo puede ocurrir durante el G 1 del ciclo celular, y el complejo cargado se activa durante la fase S mediante el reclutamiento de la proteína Cdc45 y el complejo GINS para formar la helicasa activa Cdc45-Mcm-GINS (CMG) en Horquillas de replicación de ADN. [100] [101] Se requiere actividad de Mcm a lo largo de la fase S para la replicación del ADN. [36] [102] Una variedad de factores reguladores se ensamblan alrededor de la helicasa CMG para producir el 'Complejo de progresión del replisoma' que se asocia con las ADN polimerasas para formar el replisoma eucariota, cuya estructura aún está bastante mal definida en comparación con su contraparte bacteriana. . [54] [103]
La helicasa CMG aislada y el complejo de progresión del replisoma contienen un solo complejo de anillo de proteína Mcm, lo que sugiere que el doble hexámero cargado de las proteínas Mcm en los orígenes podría romperse en dos anillos hexámeros simples como parte del proceso de iniciación, con cada anillo del complejo de proteína Mcm formando el núcleo de una helicasa CMG en las dos horquillas de replicación establecidas desde cada origen. [54] [100] Se requiere el complejo CMG completo para el desenrollamiento del ADN, y el complejo de CDC45-Mcm-GINS es la helicasa de ADN funcional en las células eucariotas. [104]
Proteínas Ctf4 y And1
El complejo CMG interactúa con el replisoma a través de la interacción con las proteínas Ctf4 y And1. Las proteínas Ctf4 / And1 interactúan tanto con el complejo CMG como con la ADN polimerasa α. [105] Ctf4 es un factor accesorio de la polimerasa α, que se requiere para el reclutamiento de la polimerasa α a los orígenes de replicación. [106]
Proteínas Mrc1 y Claspin
Las proteínas Mrc1 / Claspin acoplan la síntesis de la cadena principal con la actividad helicasa del complejo CMG. Mrc1 interactúa con la polimerasa ε así como con las proteínas Mcm. [107] La importancia de este vínculo directo entre la helicasa y la polimerasa de cadena principal se subraya por los resultados en células humanas cultivadas, donde se requiere Mrc1 / Claspin para una progresión de horquilla de replicación eficiente. [108] Estos resultados sugieren que la replicación eficiente del ADN también requiere el acoplamiento de helicasas y la síntesis de cadenas principales ...
Antígeno nuclear de células en proliferación
Las ADN polimerasas requieren factores adicionales para apoyar la replicación del ADN. Las ADN polimerasas tienen una estructura de "mano" semicerrada, que permite que la polimerasa se cargue en el ADN y comience a translocarse. Esta estructura permite que la ADN polimerasa mantenga la plantilla de ADN monocatenario, incorpore dNTP en el sitio activo y libere el ADN bicatenario recién formado. Sin embargo, la estructura de las ADN polimerasas no permite una interacción estable continua con la plantilla de ADN. [1]
Para fortalecer la interacción entre la polimerasa y la plantilla de ADN, las pinzas deslizantes de ADN se asocian con la polimerasa para promover la procesividad de la polimerasa replicativa. En eucariotas, la abrazadera deslizante es una estructura de anillo homotrímero conocida como antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA). El anillo de PCNA tiene polaridad con las superficies que interactúan con las ADN polimerasas y las ata de forma segura a la plantilla de ADN. La estabilización dependiente de PCNA de las ADN polimerasas tiene un efecto significativo sobre la replicación del ADN porque los PCNA pueden mejorar la procesividad de la polimerasa hasta 1000 veces. [109] [110] El PCNA es un cofactor esencial y tiene la distinción de ser una de las plataformas de interacción más comunes en el replisoma para acomodar múltiples procesos en la bifurcación de replicación, por lo que el PCNA también se considera un cofactor regulador para las ADN polimerasas. [111]
Factor de replicación C
El PCNA rodea completamente la hebra de la plantilla de ADN y debe cargarse en el ADN en la horquilla de replicación. En la cadena principal, la carga del PCNA es un proceso poco frecuente, porque la replicación del ADN en la cadena principal es continua hasta que finaliza la replicación. Sin embargo, en la hebra rezagada, la ADN polimerasa δ debe cargarse continuamente al comienzo de cada fragmento de Okazaki. Este inicio constante de la síntesis de fragmentos de Okazaki requiere una carga repetida de PCNA para una replicación eficaz del ADN.
La carga de PCNA se logra mediante el complejo del factor de replicación C (RFC). El complejo RFC está compuesto por cinco ATPasas: Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4 y Rfc5. [112] RFC reconoce las uniones cebador-plantilla y carga PCNA en estos sitios. [113] [114] El homotrímero de PCNA se abre mediante RFC mediante hidrólisis de ATP y luego se carga en el ADN en la orientación adecuada para facilitar su asociación con la polimerasa. [115] [116] Los cargadores de pinza también pueden descargar PCNA del ADN; un mecanismo necesario cuando se debe terminar la replicación. [116]
Horquilla de replicación estancada
La replicación del ADN en la horquilla de replicación puede detenerse por una escasez de trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP) o por daño del ADN, lo que resulta en estrés de replicación . [117] Esta detención de la replicación se describe como una bifurcación de replicación estancada . Un complejo de proteínas de protección de horquilla estabiliza la horquilla de replicación hasta que se puedan solucionar el daño del ADN u otros problemas de replicación. [117] El estancamiento prolongado de la horquilla de replicación puede provocar más daños en el ADN. Las señales de estancamiento se desactivan si se resuelven los problemas que causan la bifurcación de replicación. [117]
Terminación
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/3/3b/Working_principle_of_telomerase.png/310px-Working_principle_of_telomerase.png)
La terminación de la replicación del ADN eucariota requiere diferentes procesos dependiendo de si los cromosomas son circulares o lineales. A diferencia de las moléculas lineales, los cromosomas circulares pueden replicar la molécula completa. Sin embargo, las dos moléculas de ADN permanecerán unidas. Este problema se maneja mediante la decantación de las dos moléculas de ADN por una topoisomerasa de tipo II . Las topoisomerasas de tipo II también se utilizan para separar hebras lineales, ya que están intrincadamente plegadas en un nucleosoma dentro de la célula.
Como se mencionó anteriormente, los cromosomas lineales enfrentan otro problema que no se ve en la replicación circular del ADN. Debido al hecho de que se requiere un cebador de ARN para el inicio de la síntesis de ADN, la hebra rezagada está en desventaja en la replicación del cromosoma completo. Mientras que la cadena principal puede usar un solo cebador de ARN para extender el extremo 5 'de la cadena de ADN en replicación, múltiples cebadores de ARN son responsables de la síntesis de la cadena retrasada, creando fragmentos de Okazaki. Esto conduce a un problema debido al hecho de que la ADN polimerasa solo puede agregarse al extremo 3 'de la cadena de ADN. La acción 3'-5 'de la ADN polimerasa a lo largo de la hebra parental deja una región corta de ADN monocatenario (ssDNA) en el extremo 3' de la hebra parental cuando se han reparado los fragmentos de Okazaki. Dado que la replicación ocurre en direcciones opuestas en los extremos opuestos de los cromosomas parentales, cada hebra es una hebra rezagada en un extremo. Con el tiempo, esto resultaría en un acortamiento progresivo de ambos cromosomas hijos . Esto se conoce como problema de replicación final. [1]
El problema de la replicación final se maneja en las células eucariotas mediante las regiones de los telómeros y la telomerasa . Los telómeros extienden el extremo 3 'del cromosoma parental más allá del extremo 5' de la cadena hija. Esta estructura de ADN monocatenario puede actuar como un origen de replicación que recluta telomerasa. La telomerasa es una ADN polimerasa especializada que consta de múltiples subunidades de proteínas y un componente de ARN. El componente de ARN de la telomerasa se hibrida con el extremo 3 'monocatenario del ADN molde y contiene 1,5 copias de la secuencia telomérica. [85] La telomerasa contiene una subunidad proteica que es una transcriptasa inversa llamada telomerasa transcriptasa inversa o TERT. TERT sintetiza ADN hasta el final de la plantilla de ARN de telomerasa y luego se desconecta. [85] Este proceso se puede repetir tantas veces como sea necesario con la extensión del extremo 3 'de la molécula de ADN parental. Esta adición 3 'proporciona una plantilla para la extensión del extremo 5' de la hebra hija mediante la síntesis de ADN de la hebra retrasada. La regulación de la actividad de la telomerasa es manejada por proteínas de unión a telómeros.
Barreras de horquilla de replicación
La replicación del ADN procariótico es bidireccional; dentro de un origen replicativo, los complejos replisomas se crean en cada extremo del origen de replicación y los replisomas se alejan unos de otros desde el punto de partida inicial. En procariotas, la replicación bidireccional se inicia en un origen replicativo en el cromosoma circular y termina en un sitio opuesto al comienzo inicial del origen. [118] Estas regiones de terminación tienen secuencias de ADN conocidas como sitios Ter . Estos sitios Ter están unidos por la proteína Tus. El complejo Ter -Tus es capaz de detener la actividad helicasa, terminando la replicación. [119]
En las células eucariotas, la terminación de la replicación generalmente ocurre a través de la colisión de las dos bifurcaciones replicativas entre dos orígenes de replicación activos. La ubicación de la colisión varía según el momento del disparo de origen. De esta manera, si una bifurcación de replicación se detiene o colapsa en un sitio determinado, la replicación del sitio puede ser rescatada cuando un replisome que viaja en la dirección opuesta completa la copia de la región. Hay barreras de horquilla de replicación programadas (RFB) unidas por proteínas RFB en varias ubicaciones, en todo el genoma, que pueden terminar o pausar las horquillas de replicación, deteniendo la progresión del replisoma. [118]
Fábricas de replicación
Se ha encontrado que la replicación ocurre de forma localizada en el núcleo celular. Contrariamente a la visión tradicional de mover las horquillas de replicación a lo largo del ADN estancado, surgió un concepto de fábricas de replicación , lo que significa que las horquillas de replicación se concentran hacia algunas regiones de 'fábrica' inmovilizadas a través de las cuales pasan las hebras de ADN molde como cintas transportadoras. [120]
Regulación del ciclo celular
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/d/d0/Cell_Cycle_2.svg/220px-Cell_Cycle_2.svg.png)
La replicación del ADN es un proceso estrechamente orquestado que se controla dentro del contexto del ciclo celular . El progreso a través del ciclo celular y, a su vez, la replicación del ADN está estrechamente regulado por la formación y activación de complejos pre-replicativos (pre-RC) que se logra mediante la activación e inactivación de quinasas dependientes de ciclina (Cdks, CDK). Específicamente, son las interacciones de las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas las que son responsables de la transición de G 1 a la fase S.
Durante la fase G 1 del ciclo celular hay niveles bajos de actividad de CDK. Este bajo nivel de actividad de CDK permite la formación de nuevos complejos pre-RC pero no es suficiente para que la replicación del ADN sea iniciada por los pre-RC recién formados. Durante las fases restantes del ciclo celular, hay niveles elevados de actividad de CDK. Este alto nivel de actividad de CDK es responsable de iniciar la replicación del ADN, así como de inhibir la formación de nuevos complejos pre-RC. [2] Una vez que se ha iniciado la replicación del ADN, el complejo pre-RC se descompone. Debido al hecho de que los niveles de CDK permanecen altos durante las fases S, G 2 y M del ciclo celular, no se pueden formar nuevos complejos pre-RC. Todo esto ayuda a garantizar que no se produzca ninguna iniciación hasta que se complete la división celular.
Además de las quinasas dependientes de ciclina, se cree que se previene una nueva ronda de replicación mediante la regulación a la baja de Cdt1. Esto se logra mediante la degradación de Cdt1, así como mediante las acciones inhibidoras de una proteína conocida como geminina . La geminina se une estrechamente a Cdt1 y se cree que es el principal inhibidor de la replicación. [2] La geminina aparece por primera vez en la fase S y se degrada en la transición metafase-anafase, posiblemente a través de la ubicuinación por el complejo promotor de anafase (APC). [121]
Varios puntos de control del ciclo celular están presentes a lo largo del curso del ciclo celular que determinan si una célula progresará por completo a través de la división. Es importante destacar que en la replicación , el punto de control G 1 , o restricción, determina si comenzará o no el inicio de la replicación o si la célula se colocará en una etapa de reposo conocida como G 0 . Se impide que las células en la etapa G 0 del ciclo celular inicien una ronda de replicación porque las proteínas de mantenimiento del minicromosoma no se expresan. La transición a la fase S indica que la replicación ha comenzado.
Proteínas de punto de control de replicación
Para preservar la información genética durante la división celular, la replicación del ADN debe completarse con alta fidelidad. Para lograr esta tarea, las células eucariotas tienen proteínas en su lugar durante ciertos puntos en el proceso de replicación que son capaces de detectar cualquier error durante la replicación del ADN y son capaces de preservar la integridad genómica. Estas proteínas de punto de control son capaces de evitar que el ciclo celular entre en la mitosis para dar tiempo a la reparación del ADN. Las proteínas de los puntos de control también están involucradas en algunas vías de reparación del ADN, mientras que estabilizan la estructura de la horquilla de replicación para evitar daños mayores. Estas proteínas de punto de control son esenciales para evitar la transmisión de mutaciones u otras aberraciones cromosómicas a la descendencia.
Las proteínas eucariotas de los puntos de control están bien conservadas e involucran dos quinasas relacionadas con fosfatidilinositol 3-quinasas (PIKK), ATR y ATM . Tanto ATR como ATM comparten una secuencia de fosforilación diana, el motivo SQ / TQ, pero sus funciones individuales en las células difieren. [122]
ATR está involucrado en detener el ciclo celular en respuesta a roturas de doble hebra del ADN. ATR tiene un socio de punto de control obligado, la proteína que interactúa con ATR (ATRIP), y juntas estas dos proteínas responden a tramos de ADN monocatenario que están recubiertos por la proteína de replicación A (RPA). [123] La formación de ADN monocatenario ocurre con frecuencia, más a menudo durante el estrés de replicación. ATR-ATRIP puede detener el ciclo celular para preservar la integridad del genoma. ATR se encuentra en la cromatina durante la fase S, similar a RPA y claspin. [124]
La generación de tractos de ADN monocatenario es importante para iniciar las vías de los puntos de control aguas abajo del daño de la replicación. Una vez que el ADN monocatenario se vuelve lo suficientemente largo, el ADN monocatenario recubierto con RPA puede reclutar ATR-ATRIP. [125] Para volverse completamente activa, la quinasa ATR se basa en proteínas sensoras que detectan si las proteínas del punto de control están localizadas en un sitio válido de estrés por replicación del ADN. La pinza heterotrimérica RAD9 - HUS1 - Rad1 (9-1-1) y su cargador de pinzas RFC Rad17 son capaces de reconocer ADN con huecos o mellas. El cargador de pinzas RFC Rad17 carga 9-1-1 en el ADN dañado. [126] La presencia de 9-1-1 en el ADN es suficiente para facilitar la interacción entre ATR-ATRIP y un grupo de proteínas denominadas mediadores de puntos de control, como TOPBP1 y Mrc1 / claspin . TOPBP1 interactúa y recluta el componente Rad9 fosforilado de 9-1-1 y se une a ATR-ATRIP, que fosforila a Chk1. [127] Mrc1 / Claspin también es necesario para la activación completa de ATR-ATRIP que fosforila Chk1, la principal quinasa efectora del punto de control corriente abajo. [128] Claspin es un componente del replisoma y contiene un dominio para acoplarse con Chk1, revelando una función específica de Claspin durante la replicación del ADN: la promoción de la señalización del punto de control en el replisoma. [129]
La señalización de Chk1 es vital para detener el ciclo celular y evitar que las células entren en la mitosis con una replicación incompleta del ADN o daño al ADN. La inhibición de Cdk dependiente de Chk1 es importante para la función del punto de control ATR-Chk1 y para detener el ciclo celular y dejar tiempo suficiente para completar los mecanismos de reparación del ADN, lo que a su vez evita la herencia del ADN dañado. Además, la inhibición de Cdk dependiente de Chk1 juega un papel crítico en la inhibición de la activación de origen durante la fase S. Este mecanismo evita la síntesis continua de ADN y es necesario para la protección del genoma en presencia de estrés de replicación y posibles condiciones genotóxicas. [130] Por lo tanto, la actividad de ATR-Chk1 previene además problemas potenciales de replicación a nivel de orígenes de replicación única al inhibir el inicio de la replicación en todo el genoma, hasta que se apaga la cascada de señalización que mantiene la detención del ciclo celular.
Replicación a través de nucleosomas.
El ADN eucariota debe compactarse firmemente para encajar dentro del espacio confinado del núcleo. Los cromosomas se empaquetan envolviendo 147 nucleótidos alrededor de un octámero de proteínas histonas , formando un nucleosoma . El octámero del nucleosoma incluye dos copias de cada histona H2A , H2B , H3 y H4 . Debido a la estrecha asociación de las proteínas histonas con el ADN, las células eucariotas tienen proteínas que están diseñadas para remodelar las histonas antes de la horquilla de replicación, con el fin de permitir una progresión suave del replisoma. [131] También hay proteínas involucradas en el reensamblaje de las histonas detrás de la horquilla de replicación para restablecer la conformación del nucleosoma. [132]
Hay varias histonas chaperonas que se sabe que participan en el ensamblaje de nucleosomas después de la replicación. El HECHO complejo se ha encontrado para interactuar con el ADN polimerasa α-primase complejo, y las subunidades del complejo HECHO interactuado genéticamente con factores de replicación. [133] [134] El complejo FACT es un heterodímero que no hidroliza el ATP, pero es capaz de facilitar el "aflojamiento" de las histonas en los nucleosomas, pero la forma en que el complejo FACT puede aliviar la estrecha asociación de las histonas para la eliminación del ADN sigue sin respuesta. . [135]
Otro acompañante de histonas que se asocia con el replisoma es Asf1 , que interactúa con el complejo Mcm dependiente de los dímeros de histonas H3-H4. [136] Asf1 es capaz de pasar el dímero H3-H4 recién sintetizado a factores de deposición detrás de la horquilla de replicación y esta actividad hace que los dímeros de histona H3-H4 estén disponibles en el sitio de deposición de histonas justo después de la replicación. [137] Asf1 (y su socio Rtt109) también se ha implicado en la inhibición de la expresión génica de genes replicados durante la fase S. [138]
El factor de ensamblaje de cromatina chaperona heterotrimérica 1 ( CAF-1 ) es una proteína de formación de cromatina que participa en el depósito de histonas en ambas cadenas de ADN recién replicadas para formar cromatina. [139] CAF-1 contiene un motivo de unión a PCNA, llamado PIP-box, que permite que CAF-1 se asocie con el replisoma a través de PCNA y puede depositar dímeros de histona H3-H4 en ADN recién sintetizado. [140] [141] La chaperona Rtt106 también participa en este proceso y se asocia con los dímeros CAF-1 y H3-H4 durante la formación de la cromatina. [142] Estos procesos cargan histonas recién sintetizadas en el ADN.
Después de la deposición de las histonas H3-H4, los nucleosomas se forman por asociación de la histona H2A-H2B. Se cree que este proceso ocurre a través del complejo FACT, ya que ya está asociado con el replisoma y es capaz de unir H2A-H2B libre, o existe la posibilidad de otra chaperona H2A-H2B, Nap1. [143] Los estudios de microscopía electrónica muestran que esto ocurre muy rápidamente, ya que se puede observar que los nucleosomas forman solo unos pocos cientos de pares de bases después de la horquilla de replicación. [144] Por lo tanto, todo el proceso de formación de nuevos nucleosomas tiene lugar justo después de la replicación debido al acoplamiento de las histonas chaperonas al replisoma.
Comparaciones entre la replicación del ADN procariota y eucariota
Cuando se compara con la replicación del ADN procariota , la finalización de la replicación del ADN eucariota es más compleja e involucra múltiples orígenes de replicación y proteínas replicativas para lograr. El ADN procariótico está dispuesto en forma circular y solo tiene un origen de replicación cuando comienza la replicación. Por el contrario, el ADN eucariota es lineal. Cuando se replica, hay hasta mil orígenes de replicación. [145]
El ADN eucariota es bidireccional. Aquí el significado de la palabra bidireccional es diferente. El ADN lineal eucariota tiene muchos orígenes (llamados O) y terminales (llamados T). "T" está presente a la derecha de "O". Una "O" y una "T" juntas forman un replicón. Después de la formación del complejo de preiniciación, cuando un replicón comienza a alargarse, la iniciación comienza en el segundo replicón. Ahora, si el primer replicón se mueve en el sentido de las agujas del reloj, el segundo replicón se mueve en el sentido contrario a las agujas del reloj, hasta que se alcanza la "T" del primer replicón. En "T", ambos replicones se fusionan para completar el proceso de replicación. Mientras tanto, el segundo replicón también se mueve hacia adelante, para encontrarse con el tercer replicón. Este movimiento en sentido horario y antihorario de dos replicones se denomina replicación bidireccional.
La replicación del ADN eucariota requiere una coordinación precisa de todas las ADN polimerasas y proteínas asociadas para replicar el genoma completo cada vez que una célula se divide. Este proceso se logra a través de una serie de pasos de ensamblajes de proteínas en los orígenes de la replicación, enfocando principalmente la regulación de la replicación del ADN en la asociación de la helicasa MCM con el ADN. Estos orígenes de replicación dirigen el número de complejos de proteínas que se formarán para iniciar la replicación. En el ADN procariótico, la regulación de la replicación se centra en la unión de la proteína iniciadora de DnaA al ADN, y el inicio de la replicación se produce varias veces durante un ciclo celular. [85] Tanto el ADN procariótico como el eucariótico utilizan la unión de ATP y la hidrólisis para dirigir la carga de helicasa y, en ambos casos, la helicasa se carga en forma inactiva. Sin embargo, las helicasas eucarióticas son hexámeros dobles que se cargan en ADN bicatenario, mientras que las helicasas procarióticas son hexámeros simples cargados en ADN monocatenario. [146]
La segregación de cromosomas es otra diferencia entre las células procariotas y eucariotas ... Las células que se dividen rápidamente, como las bacterias, a menudo comienzan a segregar los cromosomas que todavía están en proceso de replicación. En las células eucariotas, la segregación cromosómica en las células hijas no se inicia hasta que se completa la replicación en todos los cromosomas. [85] A pesar de estas diferencias, sin embargo, el proceso subyacente de replicación es similar tanto para el ADN procariótico como para el eucariótico.
Replicación del ADN procariota | Replicación del ADN eucariota |
---|---|
Ocurre dentro del citoplasma | Ocurre dentro del núcleo |
Solo un origen de replicación por molécula de ADN | Tienen muchos orígenes de replicación en cada cromosoma. |
El origen de la replicación tiene una longitud aproximada de 100-200 nucleótidos o más. | Cada origen de replicación está formado por unos 150 nucleótidos. |
La replicación ocurre en un punto de cada cromosoma. | La replicación ocurre en varios puntos simultáneamente en cada cromosoma. |
Solo tiene un origen de replicación | Tiene múltiples orígenes de replicación |
La iniciación se lleva a cabo mediante la proteína DnaA y DnaB. | La iniciación se lleva a cabo por el Complejo de Reconocimiento de Origen |
Se necesita topoisomerasa | Se necesita topoisomerasa |
La replicación es muy rápida | La replicación es muy lenta |
Lista de proteínas de replicación de ADN eucariotas
Lista de las principales proteínas implicadas en la replicación del ADN eucariota:
Proteína | Función en la replicación del ADN eucariota |
---|---|
Y 1 | Carga la ADN polimerasa α en la cromatina junto con el complejo CMG en la hebra rezagada. También conocido como Ctf4 en levadura en ciernes. |
Cdc45 | Requerido para los pasos de iniciación y elongación de la replicación del ADN. Una parte del complejo de helicasa Mcm2-7. Requerido después del paso pre-RC para cargar varias proteínas para la iniciación y elongación. |
Complejo Cdc45-Mcm-GINS (CMG) | ADN helicasa funcional en células eucariotas |
Cdc6 | Requerido para ensamblar el complejo Mcm2-7 en ORC, junto con Cdt1. |
Quinasa Cdc7-Dbf4 o quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) | Proteína quinasa necesaria para el inicio de la replicación del ADN, probablemente a través de la fosforilación de las proteínas de mantenimiento del minicromosoma. |
Cdt1 | Carga el complejo Mcm2-7 en el ADN en ORC en el paso previo a RC / licencia. Inhibido en metazoos por geminina. |
Claspin | Acople la síntesis de la cadena principal con la actividad helicasa del complejo CMG. Funciona con Mrc1 |
Ctf4 | Carga la ADN polimerasa α en la cromatina junto con el complejo CMG en la hebra rezagada. El homólogo en metazoos se conoce como AND-1. |
Quinasa dependiente de ciclina (CDK) | Proteína quinasa dependiente de ciclina necesaria para el inicio de la replicación y para otros pasos posteriores. |
ADN2 | Endonucleasa de colgajo 5 'y helicasa implicadas en el procesamiento de fragmentos de Okazaki. |
ADN ligasa I | Se une a fragmentos de Okazaki durante la replicación del ADN. La actividad ligasa también es necesaria para la reparación y recombinación del ADN. |
ADN polimerasa α (Pol α) | Contiene actividad de primasa que es necesaria para iniciar la síntesis de ADN tanto en las cadenas principales como en las rezagadas. |
ADN polimerasa δ (Pol δ) | Requerido para completar la síntesis de fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada que ha sido iniciada por la ADN polimerasa α. |
ADN polimerasa ε (Pol ε) | La polimerasa de hebra principal. Sintetiza el ADN en la bifurcación de replicación. Se une temprano en los orígenes a través de Dbp11 y es necesario para cargar la ADN polimerasa α. |
Dpb11 | Proteína de iniciación de la replicación del ADN. Carga ADN polimerasa ε en complejos de prerreplicación en los orígenes. |
Fen1 | Endonucleasa de colgajo 5 'involucrada en el procesamiento de fragmentos de Okazaki. |
Géminis | Proteína que se encuentra en los metazoos y ausente de las levaduras. Se une e inactiva Cdt1, regulando así la formación del complejo prerreplicativo / de iniciación. También se sugirió promover la formación de pre-RC uniéndose y evitando así la degradación de Cdt1 |
Ginebra | Complejo tetramérico compuesto por Sld5, Psf1, Psf2, Psf3. Se asocia con el complejo pre-replicativo en el momento de la iniciación y se mueve con horquillas de replicación durante el paso de elongación. Requerido para la etapa de elongación de la replicación del ADN y tal vez parte del complejo de helicasa Mcm. |
Proteínas de mantenimiento de minicromosomas (Mcm) | Seis proteínas diferentes de la familia AAA + ATPasa que forman un hexámero en solución. Este hexámero es reclutado y cargado por ORC, Cdc6 y Cdt1 y forma un doble hexámero que se une topológicamente alrededor del ADN para formar un complejo prerreplicativo resistente a la sal. En el inicio de la replicación, Mcm2-7 se aleja de ORC con la bifurcación de replicación. |
Mcm10 | Requerido para las etapas de iniciación y elongación de la replicación del ADN. Implicado en la unión de cromatina de Cdc45 y ADN polimerasa α. También se requiere para la estabilidad de la subunidad catalítica α de la ADN polimerasa en la levadura en ciernes S. cerevisiae . |
Mrc1 | Acople la síntesis de la cadena principal con la actividad helicasa del complejo CMG. El homólogo de metazoos se conoce como Claspin. |
Complejo de reconocimiento de origen (ORC) | Complejo heterohexámero compuesto por proteínas Orc1-Orc6. Se une al ADN y ensambla el complejo Mcm2-7 en cromatina junto con Cdc6 y Cdt1. |
Antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) | Proteína trimérica con estructura en forma de anillo, encierra el ADN evitando la disociación de la ADN polimerasa. Actúa como una abrazadera deslizante para las polimerasas δ y ε, mejorando así la procesividad de las polimerasas replicativas. |
Factor de replicación C (RFC) | Carga PCNA en moldes cebados y participa en el cambio entre la ADN polimerasa ay las polimerasas replicativas δ y ε. |
Barreras de horquilla de replicación (RFB) | Unida por proteínas RFB en varios lugares del genoma. Son capaces de terminar o pausar las bifurcaciones de replicación, deteniendo la progresión del replisome. |
Proteína de replicación A (RPA) | Proteína de unión heterotrimérica monocatenaria. Estabiliza el ADN monocatenario en la horquilla de replicación. |
ARNasa H | Ribonucleasa que digiere el ARN hibridado con el ADN. Involucrado en el procesamiento de fragmentos de Okazaki. |
Sld2 | Funciones en el inicio de la replicación. Sustrato clave de CDK, la fosforilación promueve la interacción con Dpb11. Requerido para el inicio de la replicación. |
Sld3 | Funciones en el inicio de la replicación. Sustrato clave de CDK, la fosforilación promueve la interacción con Dpb11. Requerido para el inicio de la replicación. |
Telomerasa | Una ribonucleoproteína que agrega la secuencia de ADN "TTAGGG" se repite en el extremo 3 'de las cadenas de ADN en los telómeros. |
Topoisomerasas | Regular el sobreenrollamiento o subenrollamiento del ADN |
Ver también
- Replicación de ADN
- Replicación del ADN procariota
- Procesividad
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