Tinción de fluoro-jade
La tinción de fluoro-jade es un fluorocromo derivado de la fluoresceína y se usa comúnmente en disciplinas de neurociencia para marcar neuronas en degeneración en tejido ex vivo del sistema nervioso central . El primer derivado de fluoro-jade fue informado por Larry Schmued en 1997 como un método alternativo a los métodos tradicionales para marcar neuronas en degeneración como la tinción con nitrato de plata, tinción H&E o tinción Nissl . [1]Se puede preferir el fluoro-jade a otras tinciones degenerativas debido a la simplicidad de los procedimientos de tinción y la interpretación visual, que son inconvenientes comunes de las tinciones degenerativas convencionales. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual el fluoro-jade marca las neuronas en degeneración, lo que crea cierta controversia sobre la condición fisiológica real de las células marcadas.
Actualmente, existen tres tintes de fluoro-jade (Fluoro-Jade, [1] Fluoro-Jade B, [2] y Fluoro-Jade C [3] ), todos los cuales son derivados aniónicos de la fluoresceína y muy ácidos . [3] Específicamente, Fluoro-Jade es una mezcla de sales disódicas de 5-carboxifluoresceína y 6-carboxifluoresceína, mientras que Fluoro-Jade B es una mezcla de (1) 5- (6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten- 9il) benceno, ácido 1,2,4 tricarboxílico, (2) ácido 2- (6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9il) -5- (2,4-dihidroxibenzol) tereptálico disódico y (3) ácido disódico 2,5-bis (6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9il) tereptálico. [4] Las tres especies de fluoro-jade tienen una excitación similar yperfiles de emisión como fluoresceína (excitación: 495 nm; emisión: 521 nm) y, por tanto, pueden visualizarse utilizando un filtro de fluoresceína / FITC. Los tintes más nuevos, fluoro-jade B y fluoro-jade C, se desarrollaron para mejorar la relación señal / ruido, creando así compuestos superiores para visualizar una morfología neuronal más fina, incluidas dendritas, axones y terminales nerviosas.
Casi todo el tejido procesado es compatible con la tinción de fluoro-jade, incluido el tejido de roedores (ratones y ratas), primates no humanos y humanos. El tejido montado se rehidrata gradualmente con concentraciones decrecientes de alcohol . El permanganato de potasio se puede utilizar para disminuir la tinción de fondo y proteger el tejido de la decoloración y el fotoblanqueo. El fluoro-jade es altamente soluble en agua y, por lo tanto, primero se disuelve en agua destilada . Para ser específico para las neuronas en degeneración, el fluoro-jade debe usarse en un ambiente ácido, por lo tanto, el fluoro-jade se diluye más en ácido acético glacial . Se deben usar lavados adicionales con agua para enjuagar el tejido antes de secarlo y cubrirlo. [1]
Los procedimientos de tinción con fluoro-jade son flexibles y, por lo tanto, pueden adaptarse para ser compatibles con otras técnicas de tinción como la inmunohistoquímica . Se pueden realizar varias modificaciones a los procedimientos generales, como reducir las incubaciones de permanganato de potasio para evitar interrumpir el etiquetado inmunofluorescente . El fondo se puede reducir mediante métodos alternativos, como la disminución de la temperatura de tinción o la disminución de la concentración de fluoro-jade, que pueden ser más compatibles con otras técnicas de marcado. [1] Sin embargo, estas alteraciones deben determinarse empíricamente para optimizar las condiciones experimentales específicas.
Además de teñir el tejido de los sujetos tratados, deben incluirse controles positivos y negativos para garantizar la especificidad y validez del método. Normalmente, se incluye tejido de sujetos de control no tratados para mostrar especificidad por las neuronas en degeneración, ya que el fluoro-jade no debe teñir el tejido que no se degenera. Además, se incluye un control positivo para garantizar la validez de los procedimientos de tinción; para mostrar que las neuronas en degeneración se tiñerán con fluoro-jade. Un control positivo aceptable incluye tejido neurodegenerativo de sujetos en los que ya se ha validado el fluoro-jade, como los animales tratados con ácido kaínico.
