En el campo de la secuenciación genética , la genotipificación por secuenciación , también denominada GBS , es un método para descubrir polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con el fin de realizar estudios de genotipificación , como los estudios de asociación de todo el genoma ( GWAS ). [1] GBS utiliza enzimas de restricción para reducir la complejidad del genoma y genotipar múltiples muestras de ADN. [2] Después de la digestión, se realiza la PCR para aumentar la reserva de fragmentos y luego las bibliotecas de GBS se secuencian utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación, lo que generalmente resulta en lecturas de un solo extremo de aproximadamente 100 pb. [3]Es relativamente económico y se ha utilizado en el fitomejoramiento . [2] Aunque GBS presenta un enfoque similar al método de secuenciación de ADN asociado al sitio de restricción (RAD-seq), difieren en algunas formas sustanciales. [4]
Métodos
GBS es un procedimiento robusto, simple y asequible para el descubrimiento y el mapeo de SNP. En general, este enfoque reduce la complejidad del genoma con enzimas de restricción (RE) en especies de genomas grandes de alta diversidad para una secuenciación eficiente de alto rendimiento y altamente multiplexada. Mediante el uso de ER apropiados, se pueden evitar regiones repetitivas de genomas y se pueden apuntar regiones de copia inferior, lo que reduce los problemas de alineación en especies genéticamente muy diversas. El método fue descrito por primera vez por Elshire et al. (2011). [1] En resumen, los ADN de alto peso molecular se extraen y digieren utilizando un RE específico previamente definido cortando con frecuencia [5] en la principal fracción repetitiva del genoma. ApeKI es el RE más utilizado. Luego, los adaptadores de códigos de barras se ligan a extremos adhesivos y se realiza la amplificación por PCR . La tecnología de secuenciación de próxima generación se lleva a cabo dando como resultado lecturas de un solo extremo de aproximadamente 100 pb. Los datos de la secuencia sin procesar se filtran y alinean con un genoma de referencia utilizando generalmente la herramienta de alineación Burrows-Wheeler (BWA) o Bowtie 2 . El siguiente paso es identificar SNP a partir de etiquetas alineadas y puntuar todos los SNP descubiertos para diversas estadísticas de cobertura, profundidad y genotípicas. Una vez que se ha realizado una producción de SNP a gran escala para toda la especie, es posible llamar rápidamente SNP conocidos en muestras recién secuenciadas. [6]
Cuando se desarrolló inicialmente, el enfoque GBS se probó y validó en líneas endogámicas recombinantes (RIL) de una población de mapeo de maíz de alta resolución (IBM) y líneas de cebada haploide doble (DH) de la población de mapeo de Oregon Wolfe Barley (OWB). Se combinaron y procesaron simultáneamente hasta 96 muestras de ADN digeridas con RE (ApeKI) durante la construcción de la biblioteca GBS, que se verificó en un Genome Analyzer II (Illumina, Inc.). En total, se mapearon 25.185 marcas bialélicas en maíz, mientras que se mapearon 24.186 marcas de secuencia en cebada. La validación del marcador Barley GBS usando una sola línea DH (OWB003) mostró un 99% de concordancia entre los marcadores de referencia y las lecturas de GBS mapeadas. Aunque la cebada carece de una secuencia completa del genoma, GBS no requiere un genoma de referencia para el mapeo de etiquetas de secuencia, la referencia se desarrolla durante el proceso de muestreo de genotipificación. Las etiquetas también pueden tratarse como marcadores dominantes para análisis genéticos alternativos en ausencia de un genoma de referencia. Aparte del desnatado de GBS multiplex, la imputación de SNP faltantes tiene el potencial de reducir aún más los costos de GBS. GBS es un procedimiento versátil y rentable que permitirá extraer genomas de cualquier especie sin conocimiento previo de su estructura genómica. [1]
Referencias
- ↑ a b c Elshire, Robert J .; Glaubitz, Jeffrey C .; Sun, Qi; Polonia, Jesse A .; Kawamoto, Ken; Buckler, Edward S .; Mitchell, Sharon E. (4 de mayo de 2011). "Un enfoque simple y robusto de genotipado por secuenciación (GBS) para especies de alta diversidad" . PLOS ONE . 6 (5): e19379. Código bibliográfico : 2011PLoSO ... 619379E . doi : 10.1371 / journal.pone.0019379 . ISSN 1932-6203 . PMC 3087801 . PMID 21573248 .
- ^ a b Él, Jiangfeng; Zhao, Xiaoqing; Laroche, André; Lu, Zhen-Xiang; Liu, HongKui; Li, Ziqin (1 de enero de 2014). "Genotipado por secuenciación (GBS), una última herramienta de selección asistida por marcadores (MAS) para acelerar el fitomejoramiento" . Fronteras en la ciencia de las plantas . 5 : 484. doi : 10.3389 / fpls.2014.00484 . PMC 4179701 . PMID 25324846 .
- ^ Liu, Hui; Bayer, Micha; Druka, Arnis; Russell, Joanne R .; Hackett, Christine A .; Polonia, Jesse; Ramsay, Luke; Hedley, Pete E .; Waugh, Robbie (1 de enero de 2014). "Una evaluación de genotipado por secuenciación (GBS) para mapear el locus Breviaristatum-e (ari-e) en cebada cultivada" . BMC Genomics . 15 : 104. doi : 10.1186 / 1471-2164-15-104 . ISSN 1471-2164 . PMC 3922333 . PMID 24498911 .
- ^ Davey, John W .; Hohenlohe, Paul A .; Etter, Paul D .; Boone, Jason Q .; Catchen, Julian M .; Blaxter, Mark L. (1 de julio de 2011). "Descubrimiento de marcadores genéticos en todo el genoma y genotipado mediante secuenciación de próxima generación". Nature Reviews Genética . 12 (7): 499–510. doi : 10.1038 / nrg3012 . ISSN 1471-0056 . PMID 21681211 .
- ^ Heffelfinger, Christopher; Fragoso, Christopher A .; Moreno, Maria A .; Overton, John D .; Mottinger, John P .; Zhao, Hongyu; Tohme, Joe; Dellaporta, Stephen L. (2014). "Estrategias de genotipado por secuenciación flexibles y escalables para estudios de población" . BMC Genomics . 15 : 979. doi : 10.1186 / 1471-2164-15-979 . PMC 4253001 . PMID 25406744 .
- ^ "Tassel 5 GBS v2 Pipeline" . Borla 5 Fuente . Consultado el 20 de mayo de 2016 .