ADNc de GFP
El proyecto GFP-cDNA documenta la localización de proteínas en compartimentos subcelulares de la célula eucariota aplicando microscopía de fluorescencia . Los datos experimentales se complementan con análisis bioinformáticos y se publican en línea en una base de datos . Una función de búsqueda permite encontrar proteínas que contienen características o motivos de particular interés. El proyecto es una colaboración de los grupos de investigación de Rainer Pepperkok en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) y Stefan Wiemann en el Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ).
Los ADNc de nuevos marcos de lectura abiertos (ORF) identificados se etiquetan con proteína fluorescente verde (GFP) y se expresan en células eucariotas. Posteriormente, la localización subcelular de las proteínas de fusión se registra mediante microscopía de fluorescencia.
Cualquier manipulación a gran escala de los ORF requiere tecnologías de clonación que no contengan enzimas de restricción . En este sentido, los que utilizan la clonación por recombinación (Gateway de Invitrogen o Creator de BD Biosciences) han resultado ser los más adecuados. Esta tecnología de clonación se basa en mecanismos de recombinación que utilizan los fagos para integrar su ADN en el genoma del huésped . Permite que los ORF se transfieran rápida y convenientemente entre vectores funcionalmente útiles sin necesidad de clonación por restricción convencional. En el proyecto cDNA-GFP, los ORF se transfieren a la expresión CFP/YFP vectores Para el análisis de localización se generan fusiones N- y C-terminales. Esto maximiza la posibilidad de determinar correctamente la localización, ya que la presencia de GFP puede enmascarar las señales de orientación que pueden estar presentes en un extremo de la proteína nativa.
Inserte su gen de interés en el MCS aguas arriba del gen de la proteína fluorescente y exprese su gen como una fusión con el extremo N de la proteína fluorescente.
Inserte su gen de interés en el MCS corriente abajo del gen de la proteína fluorescente y exprese su gen como una fusión al extremo C-terminal de la proteína fluorescente.
Los vectores de fusión se transfectan en células Vero ( fibroblastos de riñón de mono ). Los ORF particularmente interesantes también se analizan para su localización en células PC12 y neuronas del hipocampo .
