Las endonucleasas HUH (etiquetas HUH) son proteínas de unión a ADN monocatenario (ssDNA) específicas de secuencia que se originan a partir de numerosas especies de bacterias y virus. [1] Las endonucleasas de HUH virales participan en el inicio de la replicación del círculo rodante, mientras que las de origen bacteriano inician la conjugación bacteriana . En biotecnología, se pueden utilizar para crear enlaces proteína-ADN, [2] similar a otros métodos como SNAP-tag . Al hacerlo, crean un enlace covalente 5 ' entre el ssDNA y la proteína. Las endonucleasas HUH pueden fusionarse con otras proteínas o usarse como etiquetas de proteínas.
Tipos de endonucleasas HUH
Las endonucleasas HUH se dividen ampliamente en dos categorías de enzimas : proteínas iniciadoras de la replicación (Rep) o proteínas de movilización / relaxasa . Ambos contienen pequeños dominios de proteínas que reconocen los orígenes de replicación específicos de la secuencia o el origen de la transferencia en el sitio en el que hacen mella en el ADN. El dominio de mellado de Reps tiende a ser más pequeño, del orden de 10-20 kDa, mientras que los dominios de mellado de relaxasas son más grandes, aproximadamente de 20 a 40 kDa de tamaño. [2]
Modo de acción
Las endonucleasas HUH generalmente tienen dos residuos de histidina (H) en el sitio activo que coordinan un catión metálico ( Mg 2+ o Mn 2+ ) que interactúa con la cadena principal de fosfato del ADN. Esto permite un ataque nucleofílico , más comúnmente, por una tirosina activada del fosfato escindible en la cadena principal del ADN, generando un enlace covalente 5 'con el ADNss. A diferencia de otros enfoques de enlace ADN-proteína, esta reacción se produce en condiciones ambientales y no requiere modificaciones adicionales. La cristalografía de rayos X y las estructuras de RMN han proporcionado información sobre la especificidad de la secuencia de unión al ADN. [3] [4]
Aplicaciones
- MobA relaxasa incorpora en la cápside viral del virus asociado a adeno para enlazar un conjugado ADN-anticuerpo para dirigir el virus a determinados tipos de células [5]
- La proteína PCV2 Rep fusionada a Cas9 para unir covalentemente una plantilla de reparación de ADN a Cas9, lo que resulta en un aumento de la reparación dirigida por homología en células humanas [6].
- Similar al enfoque mencionado anteriormente, Agrobacterium VirD2 relaxasa fusionado a Cas9 permitiendo para ligarse de una plantilla de la reparación del ADN para aumentar la reparación de homología dirigida en plantas [7]
- La proteína PCV2 Rep fusionada con partículas similares a la elastina (ELP) unidas a un aptámero de ADN Mucin-1 para administrar medicamentos a las células cancerosas [8]
- Relaxasas TraI, MobA y TrwC utilizadas en el ensamblaje ortogonal en nanoestructuras de ADN [9]
- La proteína PCV2 Rep fusionada con luciferasa ligada a aptámeros de ADN que detectan niveles de trombina en una muestra [10]
Referencias
- ^ Chandler, Michael; de la Cruz, Fernando; Dyda, Fred; Hickman, Alison B .; Moncalian, Gabriel; Ton-Hoang, Bao (8 de julio de 2013). "Romper y unir ADN monocatenario: la superfamilia de endonucleasas HUH" . Nature Reviews Microbiología . 11 (8): 525–538. doi : 10.1038 / nrmicro3067 . ISSN 1740-1526 . PMC 6493337 . PMID 23832240 .
- ^ a b Lovendahl, Klaus N .; Hayward, Amanda N .; Gordon, Wendy R. (24 de mayo de 2017). "Vínculos de ADN-proteína covalente dirigidos por secuencia en un solo paso usando etiquetas HUH" . Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 139 (20): 7030–7035. doi : 10.1021 / jacs.7b02572 . ISSN 0002-7863 . PMC 5517037 . PMID 28481515 .
- ^ Vega-Rocha, Susana; Byeon, In-Ja L .; Gronenborn, Bruno; Gronenborn, Angela M .; Campos-Olivas, Ramón (2007). "Estructura de la solución, unión de ADN y metal divalente del dominio de endonucleasa de la proteína de iniciación de replicación del circovirus porcino 2". Revista de Biología Molecular . 367 (2): 473–487. doi : 10.1016 / j.jmb.2007.01.002 . ISSN 0022-2836 . PMID 17275023 .
- ^ Everett, Blake A .; Litzau, Lauren A .; Tompkins, Kassidy; Shi, Ke; Nelson, Andrew; Aihara, Hideki; Evans III, Robert L .; Gordon, Wendy R. (1 de diciembre de 2019). "Estructura cristalina del dominio Rep del virus enano de trigo" . Acta Crystallographica Sección F . 75 (Parte 12): 744–749. doi : 10.1107 / S2053230X19015796 . ISSN 2053-230X . PMC 6891580 . PMID 31797816 .
- ^ Zdechlik, Alina C .; Él, Yungui; Aird, Eric J .; Gordon, Wendy R .; Schmidt, Daniel (6 de diciembre de 2019). "Ensamblaje programable de compuestos de anticuerpos-virus adenoasociados para la entrega de genes mediada por receptores" . Química del bioconjugado . 31 (4): 1093-1106. doi : 10.1021 / acs.bioconjchem.9b00790 . ISSN 1043-1802 . PMC 7676631 . PMID 31809024 .
- ^ Aird, Eric J .; Lovendahl, Klaus N .; Martin, Amber St; Harris, Reuben S .; Gordon, Wendy R. (31 de mayo de 2018). "Aumento de la eficiencia de reparación dirigida por homología mediada por Cas9 a través del anclaje covalente de la plantilla de reparación de ADN" . Biología de las comunicaciones . 1 (1): 54. doi : 10.1038 / s42003-018-0054-2 . ISSN 2399-3642 . PMC 6123678 . PMID 30271937 .
- ^ Ali, Zahir; Shami, Ashwag; Sedeek, Khalid; Kamel, Radwa; Alhabsi, Abdulrahman; Tehseen, Muhammad; Hassan, Norhan; Butt, Haroon; Kababji, Ahad; Hamdan, Samir M .; Mahfouz, Magdy M. (23 de enero de 2020). "La fusión de la endonucleasa Cas9 y la relaxasa VirD2 facilita la reparación dirigida por homología para la ingeniería precisa del genoma en el arroz" . Biología de las comunicaciones . 3 (1): 44. doi : 10.1038 / s42003-020-0768-9 . ISSN 2399-3642 . PMC 6978410 . PMID 31974493 .
- ^ Guo, Wei; Mashimo, Yasumasa; Kobatake, Eiry; Mie, Masayasu (16 de marzo de 2020). "Construcción de nanopartículas que muestran ADN mediante conjugación enzimática de ADN y polipéptidos similares a elastina utilizando una proteína de iniciación de la replicación". Nanotecnología . 31 (25): 255102. doi : 10.1088 / 1361-6528 / ab8042 . ISSN 0957-4484 . PMID 32176872 .
- ^ Sagredo, Sandra; Pirzer, Tobías; Aghebat Rafat, Ali; Goetzfried, Marisa A .; Moncalian, Gabriel; Simmel, Friedrich C .; de la Cruz, Fernando (2016). "Ensamblaje de proteínas ortogonales en nanoestructuras de ADN utilizando relajantes" . Angewandte Chemie International Edition . 55 (13): 4348–4352. doi : 10.1002 / anie.201510313 . ISSN 1521-3773 . PMC 5067690 . PMID 26915475 .
- ^ Mie, Masayasu; Niimi, Takahiro; Mashimo, Yasumasa; Kobatake, Eiry (3 de enero de 2019). "Construcción de conjugados ADN-NanoLuc luciferasa para ensayo sándwich basado en aptámeros de ADN usando proteína Rep". Cartas de biotecnología . 41 (3): 357–362. doi : 10.1007 / s10529-018-02641-7 . ISSN 0141-5492 . PMID 30603832 .