Ensayo de hemaglutinación

Ensayo de hemaglutinación de diferentes muestras de influenza diluidas de izquierda a derecha.

Ensayo de hemaglutinación indirecta para equinococosis humana. Diferentes muestras de suero diluidas de izquierda a derecha. Se sospechó seropositividad en la muestra 179

El ensayo de hemaglutinación o ensayo de hemaglutinación ( HA ) y el ensayo de inhibición de la hemaglutinación ( HI o HAI ) fueron desarrollados en 1941-42 por el virólogo estadounidense George Hirst como métodos para cuantificar la concentración relativa de virus , bacterias o anticuerpos. ^[1]

HA y HI aplican el proceso de hemaglutinación , en el que los receptores de ácido siálico en la superficie de los glóbulos rojos (RBC) se unen a la glicoproteína hemaglutinina que se encuentra en la superficie del virus de la influenza (y varios otros virus) y crean una red o estructura reticular. , de partículas de virus y glóbulos rojos interconectados. ^[2] La celosía aglutinada mantiene los glóbulos rojos en una distribución suspendida, generalmente vista como una solución rojiza difusa. La formación de la red depende de las concentraciones del virus y de los glóbulos rojos, y cuando la concentración relativa del virus es demasiado baja, los glóbulos rojos no están limitados por la red y se depositan en el fondo del pozo. La hemaglutinación se observa en presencia de estafilococos, vibrios y otras especies bacterianas, similar al mecanismo que usan los virus para causar la aglutinación de eritrocitos. ^{[3] [4]} Los RBC usados ​​en los ensayos de HA y HI son típicamente de pollos, pavos, caballos, conejillos de indias o humanos, dependiendo de la selectividad del virus o bacteria objetivo y los receptores de superficie asociados en los RBC.

Procedimiento

Un procedimiento general para HA es el siguiente: se prepara una dilución en serie del virus a través de las filas en una placa de microtitulación de 96 pocillos en forma de U o V con fondo. ^[5] La muestra más concentrada en el primer pocillo a menudo se diluye para ser 1 / 5x del stock, y los pocillos subsiguientes son típicamente diluciones dobles (1/10, 1/20, 1/40, etc.). El pozo final sirve como control negativo sin virus. Cada fila de la placa tiene típicamente un virus diferente y el mismo patrón de diluciones. Después de diluciones seriadas, se agrega una concentración estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se mezcla suavemente. La placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del período de incubación, el ensayo se puede analizar para distinguir entre pocillos aglutinados y no aglutinados. Las imágenes a lo largo de una fila normalmente progresarán desde pozos aglutinados con alta concentración de virus y una apariencia rojiza difusa a una serie de pozos con bajas concentraciones de virus que contienen una pastilla o botón rojo oscuro en el centro del pocillo.Los pocillos de baja concentración parecen casi idénticos al pocillo de control negativo sin virus. La apariencia del botón ocurre porque los glóbulos rojos no se mantienen en la estructura de celosía aglutinada y se asientan en el punto bajo del pozo de fondo en U o en V. La transición de pozos aglutinados a no aglutinados ocurre de manera distintiva, dentro de 1 a 2 pozos.

La concentración relativa, o título, de la muestra de virus se basa en el pocillo con la última apariencia aglutinada, inmediatamente antes de que se observe un sedimento. ^[6] En relación con la concentración de stock viral inicial, la concentración de virus en este pozo será una dilución de la reserva, por ejemplo, 1/40 veces. El valor del título de esa muestra es el inverso de la dilución, es decir, 40. En algunos casos, el virus está inicialmente tan diluido que nunca se observan los pocillos aglutinados. En ese caso, el título de estas muestras se asigna comúnmente como 5, lo que indica la concentración más alta posible, pero la precisión de ese valor es claramente baja. Alternativamente, si la concentración relativa del virus es extremadamente alta y los pocillos nunca pasan a la apariencia de un botón. Entonces, el valor del título se asigna comúnmente como la dilución más alta, como 5120.

El HI está estrechamente relacionado con el ensayo HA, pero incluye anticuerpos antivirales como "inhibidores" para interferir con la interacción virus-RBC. El objetivo es caracterizar la concentración de anticuerpos en el antisuero u otras muestras que contengan anticuerpos. ^[7] El ensayo HI se realiza generalmente creando una serie de diluciones de antisuero en las filas de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cada fila suele ser una muestra diferente. Se agrega una cantidad estandarizada de virus o bacterias a cada pocillo y se deja incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos. El último pocillo de cada fila sería un control negativo sin virus agregado. Durante la incubación, los anticuerpos se unen a las partículas virales, y si la concentración y la afinidad de unión de los anticuerpos son lo suficientemente altas, las partículas virales se bloquean eficazmente para que no provoquen hemaglutinación. ^[8] A continuación, se agrega una cantidad estandarizada de glóbulos rojos a cada pocillo y se deja incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos más. Las imágenes de la placa HI ​​resultantes generalmente progresan desde pocillos de "botón" no aglutinados con alta concentración de anticuerpos a pocillos rojos difusos aglutinados con baja concentración de anticuerpos. El valor del título HI es el inverso de la última dilución de suero que inhibió completamente la hemaglutinación. ^[9]

Las descripciones anteriores de los procesos HA y HI son generalizadas y los detalles específicos pueden variar según el operador y el laboratorio. Por ejemplo, se describen diluciones seriadas en las filas, pero algunos laboratorios utilizan una orientación alternativa y en su lugar realizan diluciones en las columnas. De manera similar, la dilución inicial, el factor de dilución en serie, los tiempos de incubación y la elección de la placa de fondo en U o en V pueden depender del laboratorio específico.

Ventajas

HA y HI tienen la ventaja de que los ensayos son simples, utilizan instrumentos y suministros relativamente económicos y disponibles, y proporcionan resultados en unas pocas horas. Los ensayos también están bien establecidos en muchos laboratorios de todo el mundo, lo que permite cierta medida de credibilidad, comparación y estandarización. ^{[10] [11]}

Limitaciones

Los resultados óptimos y confiables requieren el control de varias variables, como los tiempos de incubación, la concentración de glóbulos rojos y el tipo de glóbulos rojos. ^[12] Los factores no específicos de la muestra pueden provocar interferencias y valores de título incorrectos. Por ejemplo, las moléculas de la muestra distintas de los anticuerpos específicos del virus pueden inhibir la aglutinación entre el virus y los eritrocitos, así como bloquear potencialmente la unión del anticuerpo al virus. Las enzimas destructoras de receptores (RDE) se utilizan comúnmente para tratar muestras antes del análisis para prevenir una inhibición inespecífica. ^[13] El análisis de los resultados de HA o HI depende de un individuo calificado para leer la placa y determinar los valores de título. El método de interpretación manual presenta más oportunidades de discrepancias en el ensayo porque los resultados pueden ser subjetivos y el acuerdo entre lectores humanos es inconsistente. ^[14] Además, no existe un registro digital de la placa o las determinaciones del título, por lo que la interpretación inicial es tediosa y comúnmente se realiza en réplicas. La gama de posibles variables y diferencias entre lectores expertos puede dificultar la comparación de resultados entre laboratorios. ^[15]

Ver también

• Hemaglutinación
• Cuantificación de virus

Referencias

1. Hirst, GK (1942). "La determinación cuantitativa de virus de la influenza y anticuerpos mediante aglutinación de glóbulos rojos" . J Exp Med . 75 (1): 49–64. doi : 10.1084 / jem.75.1.49 . PMC  2135212 . PMID  19871167 .
2. "Caracterización antigénica-actividad de la influenza y vigilancia-influenza estacional (gripe)" . CDC . 2019-10-15.
3. Neter, E; Gorzynski, EA; Zalewski, J; Rachman, R; Gino, RM (1954). "Estudios sobre hemaglutinación bacteriana" . Revista estadounidense de salud pública . 44 (1): 49–54. doi : 10.2105 / ajph.44.1.49 . PMC 1620628 . PMID 13114484 .  
4. Neter, E (1956). "Hemaglutinación y hemólisis bacteriana" . Laboratorios de Investigación Statler y Departamento de Pediatría, Hospital de Niños, Laboratorio de Bacteriología, Instituto Conmemorativo de Roswell Park, y Departamentos de Pediatría y Bacteriología, Universidad de Buffalo, Facultad de Medicina, Buffalo, Nueva York . 20 (3): 166-182. PMC 180858 . PMID 13363771 .  
5. QUIÉN. "Detección serológica de infecciones por el virus de la influenza aviar A (H7N9) mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de pavo - Procedimientos de laboratorio" (PDF) . OMS.
6. QUIÉN. "Detección serológica de infecciones por el virus de la influenza aviar A (H7N9) mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de pavo - Procedimientos de laboratorio" (PDF) . OMS.
7. Noah, DL; Hill, H; Hines, D; Mientras, EL; Wolff, MC (2009). "Calificación del ensayo de inhibición de la hemaglutinación en apoyo de la licencia de la vacuna contra la influenza pandémica" . Inmunología de vacunas de Clin . 16 (4): 558–566. doi : 10.1128 / cvi.00368-08 . PMC 2668270 . PMID 19225073 .  
8. Webster, R; Cox, N; Stohr, K (2002). Manual de la OMS sobre diagnóstico y vigilancia de la influenza animal (PDF) . OMS.
9. Virocyt. "Una descripción general de las técnicas de cuantificación de virus" (PDF) . Virocyt. Archivado desde el original (PDF) el 3 de marzo de 2016 . Consultado el 8 de junio de 2015 .
10. Virocyt. "Una descripción general de las técnicas de cuantificación de virus" (PDF) . Virocyt. Archivado desde el original (PDF) el 3 de marzo de 2016 . Consultado el 8 de junio de 2015 .
11. Noah, DL; Hill, H; Hines, D; Mientras, EL; Wolff, MC (2009). "Calificación del ensayo de inhibición de la hemaglutinación en apoyo de la licencia de la vacuna contra la influenza pandémica" . Inmunología de vacunas de Clin . 16 (4): 558–566. doi : 10.1128 / cvi.00368-08 . PMC 2668270 . PMID 19225073 .  
12. QUIÉN. "Detección serológica de infecciones por el virus de la influenza aviar A (H7N9) mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de pavo - Procedimientos de laboratorio" (PDF) . OMS.
13. QUIÉN. "Detección serológica de infecciones por el virus de la influenza aviar A (H7N9) mediante el ensayo de inhibición de la hemaglutinación de pavo - Procedimientos de laboratorio" (PDF) . OMS.
14. Madera, J; Laurie, K; Engelhardt, O (septiembre de 2013). "Un examen comparativo de los protocolos de ensayo de inhibición de la hemaglutinación de la influenza: desarrollo de un protocolo de consenso HI" (4ª reunión internacional). CONSISE.
15. Madera, JM; Mayor, D; Heath, A; Newman, RW; Hoschler, K; Stephenson, yo; Clark, T; Katz, J; Zambon, MC (2012). "Reproducibilidad de los ensayos de serología para la influenza pandémica H1N1: estudio colaborativo para evaluar un candidato estándar internacional de la OMS". Vacuna . 30 (2): 210–217. doi : 10.1016 / j.vaccine.2011.11.019 . PMID 22100887 .