Inmunofluorescencia
La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para la luz de microscopía con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en microbiológicos muestras. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos frente a su antígeno para dirigir los tintes fluorescentes hacia dianas biomoléculas específicas dentro de una célula y, por lo tanto, permite la visualización de la distribución de la molécula diana a través de la muestra. La región específica que un anticuerpo reconoce en un antígeno se llama epítopo. [1]Se han realizado esfuerzos en el mapeo de epítopos ya que muchos anticuerpos pueden unirse al mismo epítopo y los niveles de unión entre anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden variar. [2] Además, la unión del fluoróforo al anticuerpo en sí no puede interferir con la especificidad inmunológica del anticuerpo o la capacidad de unión de su antígeno. [3] La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de inmunotinción (usando anticuerpos para teñir proteínas) y es un ejemplo específico de inmunohistoquímica (el uso de la relación anticuerpo-antígeno en los tejidos). Esta técnica utiliza principalmente fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos. [4]
La inmunofluorescencia se puede usar en secciones de tejido, líneas celulares cultivadas o células individuales, y se puede usar para analizar la distribución de proteínas , glucanos y pequeñas moléculas biológicas y no biológicas. Esta técnica incluso se puede utilizar para visualizar estructuras como filamentos de tamaño intermedio. [5] Si aún no se ha determinado la topología de una membrana celular, la inserción de epítopos en proteínas se puede utilizar junto con la inmunofluorescencia para determinar las estructuras. [6]La inmunofluorescencia también se puede utilizar como un método "semicuantitativo" para conocer los niveles y patrones de localización de la metilación del ADN, ya que es un método que requiere más tiempo que los métodos cuantitativos verdaderos y existe cierta subjetividad en el análisis de los niveles de metilación. [7] La inmunofluorescencia se puede usar en combinación con otros métodos de tinción fluorescente sin anticuerpos, por ejemplo, el uso de DAPI para marcar el ADN . Se pueden utilizar varios diseños de microscopios para el análisis de muestras de inmunofluorescencia; el más simple es el microscopio de epifluorescencia , y el microscopio confocal también se usa ampliamente. Varias superresolucionesTambién se pueden utilizar diseños de microscopios que son capaces de una resolución mucho mayor. [8]
Para producir anticuerpos marcados con fluorocromo, se debe conjugar ("etiquetar") un fluorocromo con el anticuerpo. Asimismo, un antígeno también se puede conjugar con el anticuerpo con una sonda fluorescente en una técnica llamada técnica de antígeno fluorescente. Los procedimientos de tinción pueden aplicarse tanto al antígeno fijado en el citoplasma como a los antígenos de la superficie celular de las células vivas, lo que se denomina "inmunofluorescencia de membrana". También es posible marcar el complemento del complejo anticuerpo-antígeno con una sonda fluorescente. Además del elemento al que se unen las sondas de fluorescencia, existen dos clases generales de técnicas de inmunofluorescencia: primaria y secundaria. Las siguientes descripciones se centrarán principalmente en estas clases en términos de anticuerpos conjugados. [3]
Hay dos clases de técnicas de inmunofluorescencia, primarias (o directas) y secundarias (o indirectas).
