El marcaje isobárico es una estrategia de espectrometría de masas utilizada en proteómica cuantitativa . Los péptidos o proteínas están marcados con varios grupos químicos que son (al menos nominalmente) masas idénticas (isobáricas), pero varían en términos de distribución de isótopos pesados alrededor de su estructura. Estas etiquetas, comúnmente denominadas etiquetas de masa en tándem, están diseñadas para que la etiqueta de masa se escinda en una región de enlace específica en CID de alta energía (HCD) durante la espectrometría de masas en tándem que produce iones informadores de diferentes masas. Las etiquetas isobáricas más comunes son las etiquetas reactivas con amina. [1]Sin embargo, también se han descrito etiquetas que reaccionan con residuos de cisteína y grupos carbonilo. [2] Estos grupos reactivos con amina pasan por reacciones de N-hidroxisuccinimida (NHS), que se basan en tres tipos de grupos funcionales. [2] Los métodos de etiquetado isobárico incluyen etiquetas de masa en tándem (TMT) , etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) , etiquetas de diferencia de masa para cuantificación absoluta y relativa y marcaje de dimetilo. [1] Los métodos TMT y iTRAQ son los más comunes y desarrollados de estos métodos. [1] Las etiquetas de masa en tándem tienen una región indicadora de masa, una región de enlace divisible, una región de normalización de masa y un grupo reactivo de proteínas y tienen la misma masa total.[3]
Flujo de trabajo
(Yates, 2014) describe un flujo de trabajo típico de proteómica ascendente . [2] Las muestras de proteínas son digeridas enzimáticamente por una proteasa para producir péptidos. Cada muestra experimental digerida se deriva con una variante isotópica diferente de la etiqueta de un conjunto. Las muestras se mezclan en proporciones típicamente iguales y se analizan simultáneamente en una serie de MS. Dado que las etiquetas son isobáricas y tienen propiedades químicas idénticas, las variantes isotópicas de las etiquetas aparecen como un solo pico compuesto con el mismo valor m / z en una exploración MS1 con tiempos de retención de cromatografía líquida (LC) idénticos. Durante un análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), los péptidos fragmentados producen iones producto específicos de secuencia. Estos iones de producto se utilizan para determinar la secuencia del péptido y las etiquetas indicadoras cuyas abundancias reflejan la proporción relativa del péptido en las muestras que se combinaron. Se requiere el uso de MS / MS para detectar las etiquetas, por lo tanto, los péptidos no etiquetados no se cuantifican.
Ventajas
Explicado previamente por (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). [4] Un beneficio clave del etiquetado isobárico sobre otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, sin etiquetas) son las capacidades de multiplexación y, por lo tanto, un mayor potencial de rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una ejecución de LC-MS elimina la necesidad de analizar varios conjuntos de datos y elimina la variación de ejecución a ejecución. La multiplexación reduce la variabilidad del procesamiento de muestras, mejora la especificidad al cuantificar los péptidos de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Sin la multiplexación, se puede perder información de una serie a otra, lo que afecta la identificación y cuantificación, ya que los péptidos seleccionados para la fragmentación en una serie de LC-MS / MS pueden no estar presentes o no estar en la cantidad adecuada en las siguientes series de muestras. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de 2 a 11 muestras experimentales.
Aplicaciones
El marcaje isobárico se ha utilizado con éxito para muchas aplicaciones biológicas, incluida la identificación y cuantificación de proteínas, el perfil de expresión de proteínas de estados normales frente a anormales, el análisis cuantitativo de proteínas para las que no hay anticuerpos disponibles y la identificación y cuantificación de proteínas modificadas postraduccionalmente. [4]
Disponibilidad
Hay dos tipos de etiquetas isobáricas disponibles comercialmente: etiquetas de masa en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) . Los TMT reactivos con amina están disponibles en conjuntos dúplex, 6-plex y 10-plex y ahora 11-plex. [5] Los iTRAQ reactivos con amina están disponibles en formas de 4 plex y 8 plex [6] .
Referencias
- ^ a b c Bantscheff, Marcus; Lemeer, Simone; Savitski, Mikhail M .; Kuster, Bernhard (1 de septiembre de 2012). "Espectrometría de masas cuantitativa en proteómica: actualización de revisión crítica desde 2007 hasta la actualidad". Química analítica y bioanalítica . 404 (4): 939–965. doi : 10.1007 / s00216-012-6203-4 . ISSN 1618-2650 . PMID 22772140 .
- ^ a b c Yates, John (2014). "Cuantificación relativa basada en etiquetado isobárico en proteómica de escopeta" . Revista de investigación del proteoma . 13 (12): 5293–5309. doi : 10.1021 / pr500880b . PMC 4261935 . PMID 25337643 .
- ^ Thompson, Andrew; Schäfer, Jürgen; Kuhn, Karsten; Kienle, Stefan; Schwarz, Josef; Schmidt, Günter; Neumann, Thomas; Hamon, Christian (2003). "Etiquetas de masa en tándem: una nueva estrategia de cuantificación para el análisis comparativo de mezclas de proteínas complejas por MS / MS" . Química analítica . 75 (8): 1895-1904. doi : 10.1021 / ac0262560 . ISSN 0003-2700 . PMID 12713048 .
- ^ a b Lee, Kelvin H .; Choe, Leila H .; Aggarwal, Kunal (1 de junio de 2006). "Proteómica de escopeta usando las etiquetas isobáricas iTRAQ" . Sesiones informativas sobre genómica funcional . 5 (2): 112-120. doi : 10.1093 / bfgp / ell018 . ISSN 2041-2649 . PMID 16772272 .
- ^ Dayon L, Hainard A, Licker V, Turck N, Kuhn K, Hochstrasser DF, Burkhard PR, Sanchez JC (2008). "Cuantificación relativa de proteínas en fluidos cerebroespinales humanos por MS / MS usando etiquetas isobáricas de 6 plex" . Anal. Chem . 80 (8): 2921–31. doi : 10.1021 / ac702422x . PMID 18312001 .
- ^ Choe L, D'Ascenzo M, Relkin NR, Pappin D, Ross P, Williamson B, Guertin S, Pribil P, Lee KH (2007). "Cuantificación de 8 plex de cambios en la expresión de proteínas del líquido cefalorraquídeo en sujetos sometidos a tratamiento con inmunoglobulina intravenosa para la enfermedad de Alzheimer" . Proteómica . 7 (20): 3651–60. doi : 10.1002 / pmic.200700316 . PMC 3594777 . PMID 17880003 .