Lisado de amebocitos de Limulus
El lisado de amebocitos de Limulus ( LAL ) es un extracto acuoso de células sanguíneas ( amebocitos ) del cangrejo herradura del Atlántico Limulus polyphemus . LAL reacciona con la endotoxina bacteriana lipopolisacárido (LPS), que es un componente de la membrana de las bacterias gramnegativas . Esta reacción es la base de la prueba LAL , que es ampliamente utilizada para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas .
En Asia, en su lugar se usa ocasionalmente una prueba similar de lisado de amebocitos de Tachypleus ( TAL ) basada en los cangrejos de herradura locales Tachypleus gigas o Tachypleus tridentatus . [1] El ensayo del factor C recombinante (rFC) es un reemplazo de LAL/TAL basado en una reacción similar. [2]
El investigador médico estadounidense Fred Bang informó en 1956 que las bacterias gramnegativas, incluso si mueren, harán que la sangre del cangrejo herradura se convierta en una masa semisólida. Más tarde se reconoció que las células sanguíneas del animal, células móviles llamadas amebocitos , contienen gránulos con un factor de coagulación conocido como coagulógeno ; esta se libera fuera de la célula cuando se encuentra la endotoxina bacteriana. Se cree que la coagulación resultante (gelificación) contiene infecciones bacterianas en el sistema circulatorio semicerrado del animal . [3]El análisis moderno del lisado ha llevado a la comprensión de este sistema de cascada, con múltiples enzimas trabajando en secuencia para producir el gel. El punto de entrada de la coagulación inducida por endotoxinas es el factor de coagulación C de Limulus. [4]
En 1977, la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) aprobó LAL para probar medicamentos, productos y dispositivos que entran en contacto con la sangre. Con anterioridad a esa fecha, se había utilizado para este fin una prueba mucho más lenta y costosa en conejos . [5]
Se recolectan cangrejos herradura y se extrae sangre del pericardio del cangrejo herradura ; los cangrejos luego se devuelven al agua. Los fabricantes de LAL han medido tasas de mortalidad del 3% en cangrejos desangrados; sin embargo, estudios recientes indican que este número puede estar más cerca del 15 % [6] o incluso del 30 %. [7] Las células sanguíneas se separan del suero mediante centrifugación y luego se colocan en agua destilada, lo que hace que se hinchen y revienten ("lisis"). Esto libera los químicos del interior de la célula (el "lisado"), que luego se purifica y se seca por congelación . Para analizar una muestra en busca de endotoxinas, se mezcla con lisado y agua; las endotoxinas están presentes si se produce la coagulación. [8]
Existen tres metodologías básicas: gel-clot, turbidimétrica y cromogénica. La aplicación principal de LAL es la prueba de productos farmacéuticos parenterales y dispositivos médicos que entran en contacto con sangre o líquido cefalorraquídeo . En los Estados Unidos, la FDA ha publicado una guía para la validación de la prueba LAL como prueba de endotoxinas para dichos productos. [9]
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